Биологический каталог




Биоорганическая химия

Автор Г.Дюга, К.Пенни

осуществляемая карбоксилазой, протекает в сторону образования АТР в присутствии полученного синтетически l'-N-кар-poKCH-(-f-)-биотина. Кроме того, синтетический l'-N-карбокси-|(-f-)-биотин по своей устойчивости не отличается от карбоксибио-тина, полученного ферментативно.

Эти данные показали, что l'-N-положение уреидогруппы био-кгина служит центром переноса карбоксильной группы в биотин-вависимых ферментах. Лейн также правильно указал на то, что v -> N-миграция должна была бы предшествовать участию карбо-ксибиотина в ферментативном процессе. Однако хорошо установленная термодинамическая и кинетическая стабильность N-ациль-ных и 1^-карбоксил-2-имидазолидоновых производных делает такую возможность маловероятной. Кроме того, карбоксилаза мочевины, входящая в состав АТР-амидолиазы, — также биотинзави-симый фермент — обратимо карбоксилирует мочевину с образованием N-карбоксимочевины. Это довольно известный пример кар-§ оксидирования по N-положению уреидогруппы [333].

р О

Н2гГ7ЧН2 + НС03е ' H2N'^-NH—СОО6 пп "'° -

карБокс 8888»

лага N-карБоксиМоче-мочевины еина (аллофанат)

-- 2 НСО,е + 2 NH4®

Лейн и сотр. высказывали также различные соображения от-осительно того, почему карбоксибиотиновая простетическая Группа в таких ферментативных процессах выбирает в качестве карбоксилирующего агента Г-N-, а не более активный 2'-0-атом уреидогруппы. Они предполагают, что, возможно, последующее ркспонирование подвижной переносящей карбоксильную группу епи в растворителе приведет к понижению способности карбо-ксилата к переносу. Это должно предотвращать О -> N-миграцию в процессе переноса.

Вернемся к нерешенной проблеме выявления способов активации биотина и карбоксибиотина. Ранее в этой главе приведены три возможных механизма карбоксилирования субстрата риотином. Один из них, выдвинутый Клугером и Адавадкаром [[341], предполагает существование О-фосфобиотинового промежуточного соединения. В настоящее время Клугер разработал интересную модель такого механизма, в которой фосфорильная группа нерез метиленовый мостик связана с атомом азота уреидогруппы.

Исходное вещество было синтезировано из диметилмочевины, а его гидролиз в присутствии LiOH приводит к образованию модельного соединения, обладающего активными фрагментами молекулы биотина и АТР, соединенными тем же способом.

%А1Ф

Н СНз

сн

н сн.

о

II

-Р—OeU'

\

о

N^Ssr—СН,

СН3

о=р—'

I

осн,

сн

X

он

О г

н сн,

он

о

f\jH

HN

СН3 СН3

сн,

н сн,

TsOH^CHCl, In*. \

интермеЭиахп карбодиимиЭного типа fO-фосфорилированный оксиамиоиний-ион)

СН

CH,N,

о ^осн3

1 Х>СН3

N^N' I I H CH,

В водном растворе, содержащем кислоту, продукт очень быстро гидролизуется, и гидролиз протекает через образование циклического промежуточного соединения — фосфомочевины. На основании данных по гидролизу и других свойств родственных соединений Клугер предположил, что остаток мочевины в биотине — выступает как нуклеофил по отношению к фосфатным производным. Таким образом, АТР, НСОз и биотин могут связываться вблизи карбоксилирующей субъединицы, Давая О-фосфобиотин — подобный карбодиимиду дегидратирующий агент,— который может конденсироваться с НСОз и перегруппировываться в l'-N-карбоксибиотин (рис. 7.14). Возможность О-фосфобиотинового механизма впервые предполагалась Калвином в 1959 г. Однако э~и новые данные интересны тем, что они демонстрируют нукле-

Химия коферментов

481

офильные свойства 2'-0-атома уреидогруппы биотина к фосфору.

I Келлог [347] синтезировал интересное соединение для моделирования важной особенности второй стадии реакции — переноса карбоксильной группы от атома азота в биотине на акцепторную молекулу. Он обнаружил, что литиевое производное N-метилэтиленмочевины (или тиомочевины), моделирующее изомо-чевинную форму биотина, способно вызывать перегруппировку

-метил-4-метиленбензоксазин-3,1-она-2 в 4-окси-1-метил-2-хино-|кин. N-Метильное производное N-метилэтиленмочевины улуч-Ьнает растворимость компонентов реакции в ТГФ и способствует [отщеплению только одного атома водорода. Такой изомеризации не происходит в случае органических оснований, таких, как IR4N+OH- и пиридин, а также LiOH. Но если изомочевину активировать с помощью BuLi, реакция протекает со степенью превращения 49% (при кипячении в ТГФ в течение 15 мин) и выдернется с выходом 10% аддукт:

Весьма вероятен следующий механизм этого кооперативного ¦роцесса:

СН,—N NH

сн

СН3

фи9

СНз

СН,

16 Зак. 649

482

Глава 7

В некотором смысле это превращение моделирует карбоксилиро-вание биотина по азоту и последующий перенос карбоксильной группы к атому углерода, связанному с карбонильной группой.

Клугер и сотр. подробно исследовали механизм участия мочевины в гидролизе фосфоэфиров [334]. Помимо получения дополнительного доказательства возможного участия О-фосфобиотина в АТР-зависимых реакциях карбоксилиро-вания в ферментативных системах они также рассмотрели стереохимию путей карбоксилирования О-фосфобиотина в ферментативных реакциях, приводящих к образованию N-карбоксибиотина и фосфат-иоиа. Возможны два механизма с участием пеитакоординационного промежуточного соединения (см. замечания о псевдовращении в гл. 3): механизм «атаки с фронта», не подразумевающий образования карбоксифосфата, и механизм «атаки с тыла» с образованием свободного карбоксифосфата.

Механизм «атаки с фронта» ведет к сохранению конфигурации у атома фосфора:

Механизм «атаки с тыла» вызывает обращение конфигурации у атома фосфора:

Химия коферментов

483

В случае атаки с тыла бикарбонат атакует О-фосфобиотин по транс-поло-ению относительно биотиноеой уреидогруппы. Если это имеет место, то со-ласованная атака с тыла, сопровождаемая карбоксилированием, стереохими-иески невозможна. Следовательно, при таком механизме должен образовываться карбоксифосфат. В то же время механизм атаки с фронта обеспечивает |протекание реакции без образования карбоксифосфата из-за более благоприятного пространственного расположения бикарбоната. Хотя этот механизм соответствует ранее предполагаемому [341], необходимы дополнительные исследования для решения неопределенности, касающейся стереохимии карбоксилирования О-фосфобиотина в ферментативных процессах. Эту проблему можно решить с помощью структурного анализа биотинзависимого фермента.

В заключение скажем, что образование О-фосфобиотина из |АТР, по-видимому, происходит с обращением конфигурации у ^-фосфора. Поскольку последующий перенос к бикарбонату мо-|жет происходить с сохранением конфигурации или инверсией, то путь через О-фосфобиотин может объяснить результирующую

СоА—S'

0- -N NH

СоА—S—С=0 I

СН,—СН +

ОН

I X

СОге N" NH

О-.

Рис. 7.18. Согласованный механизм карбоксилирования пропионил-СоА.

инверсию (инверсия и сохранение конфигурации) или результирующее сохранение конфигурации (инверсия плюс инверсия) L атома фосфора [334].

Наконец, следует сказать о стереохимии реакции карбоксилирования. Аригони и сотр. [335] первыми показали с помощью [гритиевой метки, что карбоксилирование пропионовой кислоты происходит с сохранением конфигурации.

СН3 СН, т-__и гфстиония СоАг иплг

СООН

2s-[2-5H] пропионовая кислота

«Н

СООН

метилмалоновая кислота

Как и другие биотинзависимые реакции карбоксилирования, эта реакция включает отщепление а-протона (здесь трития) и [замещение его на С02. Предполагается [336, 345], что отщепление протона и карбоксилирование проходят согласованно (рис. 7.18).

J6*

484

Глава 7

Однако согласованный механизм, хотя и мог бы объяснить сохранение конфигурации в процессе переноса карбоксильной группы, стереохимически маловероятен.

Происходящие в процессе реакции превращения означают, что карбонильная группа биотина служит акцептором протонов в одном случае и донором протонов в другом. Более вероятный механизм предполагает наличие внешнего основания. Таким образом, альтернативой согласованному механизму служит ступенчатый процесс, включающий отщепление а-протона с последующим карбоксилированием. Чтобы показать возможность такого механизма, было исследовано [346] действие пропионил-СоА-карбо-

Рис. 9.13. Механизм отщеплеьия

Химия коферментов

485

ксилазы на (3-фторпропионил-СоА. Этот субстрат особенно удобен для изучения возможности отщепления протона в отсутствие карбоксилирования, так как: 1) фтор — это небольшой атом, и iero присутствие не приводит к стерическим затруднениям, 2) когда карбанион возникает в (3-положении к углероду, несущему атом фтора, последний элиминируется. Таким образом, отщепление фтора служит доказательством образования карбаниона.

(HF)

выстро (через промежуточный карбанион, связанный с ферментом;

Hisf^4NT

-СО,

сн2=сн-сс^

a S—СоА

ЗекарВоксилироеание, cti И ускоряемое в присутствии *-и2 акрилил-СоА

i—CH2=

CH—С

BH

4S—СоА

fopa из фторпропионил-СоА [346].

Фтор!

Е-биотин (регенерированный)

со2е

1 ^° + CH2—CH—C^ + H®

I S—CoA

F i

i «ферментативное ¦бекарбоксилирование j(побочная реакция)

сн2=сн^с

о

ч

+ C02 + Fe

S—СоА

486

Глава 7

При инкубации р-фторпропионил-СоА в присутствии НСОз, АТР и Mg(II) и добавлении этой смеси к ферменту образуется ADP и освобождается F-. Однако скорость освобождения F-в 6 раз превышает скорость образования ADP, и доказательства образования фторметилмалонил-СоА не удалось получить. Освобождение F-— доказательство отщепления а-протона от субстрата, а образование ADP соответствует образованию биотин-С02. Следовательно, эти результаты свидетельствуют о том, что отщепление водорода может не сопровождаться переносом С02 от биотин-С02 на субстрат. Выдвинутый ранее согласованный механизм, таким образом, неприменим, в случае действия пропионил-СоА-карбоксилазы на (3-фторпропионил-СоА. Предполагается также, что несогласованный процесс должен происходить с «нормальными» субстратами и что активный центр фермента должен содержать группу, которая функционирует как акцептор протонов. Более того, было показано, что этот центр не обменивает протоны с растворителем.

Короче говоря, можн

страница 79
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89

Скачать книгу "Биоорганическая химия" (8.62Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(24.08.2017)