нуклео-фильнуго атаку

Затем этот активированный бикарбонат реагирует со связанным с ферментом биотином, давая l'-N-карбоксибиотин — другое активированное карбонатное производное. Эти два процесса могут происходить согласованно, что в течение некоторого времени было общепринятой концепцией. Промежуточный l'-N-карбоксибиотин устойчив в щелочных условиях, но легко декарбоксилируется в кислой среде. В приведенном выше примере карбоксибиотин реагирует с еноль-ной формой ацетил-СоА, давая малонил-СоА и регенерированный биотин. Как и ожидали, один атом кислорода бикарбоната появляется в фосфат-ионе, а два других — в карбоксильной группе малонил-СоА.

Клугер и Адавадкар [341] предложили интересный вариант механизма, согласно которому первая стадия включает образование О-фосфобиотина, аналогичного по структуре аддуктам фосфатов с карбодиимидом (рис. 7.14). Подобные аддукты О-фосфорилмочевины уже обсуждались в гл. 3.

Изоимидный интермеднат (О-ацилмочевина) реагирует с бикарбонатом, а затем разлагается, образуя l'-N-карбоксибиотин и фосфат-ион. Чтобы подтвердить существование этого интермедиата, было синтезировано интересное модельное соединение (разд. 7.4.1).

Наконец, Сталлингс [342] предложил третий механизм, основанный на изучении образования водородных связей в кристаллической структуре биотина (рис. 7.15). По его мнению, биотин и бикарбонат образуют комплементарные водородные связи и дают «устойчивый» интермеднат. Приближение АТР инициирует карбоксилирование путем поляризации связи и кето-енольной тауто-меризации уреидогруппы, что увеличивает нуклеофильность положения N-1'. Участие енольной формы биотина подтверждается кристаллографическими исследованиями биотина. Заметим, что предыдущий механизм такж^ подразумевает образование енольного промежуточного соединения.

Химия коферментов

473

О

еО—Р—О—ADP

ангийрианьш интермеЭиат „карбобиимиЭногЬ" типа

е-- > ^в fO?f \>°

Mg2

Н» (Ж

TSIH)

ср.с

¦R

О

О II"

С—R'

I

R

О

,ХХТХ,

JEMT ХК

ш

¦R

о *) 9

Р—•—^—>

активированная с помоцью ДЦГК кислота

D

е

•Н

+ О

« II «

А*

Рис. 7.14. Возможный механизм действия биотина [341].

¦ Следовательно, участие АТР смещает равновесие в сторону енольной фор-ы. Этот последний механизм — пример активации субстратом Связывая би-^бонат, данный субстрат увеличивает нуклеофильность биотинового кофак-

О—Р—в—ADP е I \f

1

т

о

+ Н»—Р—Оё + ADP Рис. 7.15 Другой гипотетический механизм действия биотина [342].

тора. Однако нельзя исключить образования активированного бикарбоната, как предполагает первый механизм. Во всех трех рассмотренных случаях роль (ионов Mg(II) может заключаться в связывании ADP. Интересно также, что во всех трех случаях действие биотина состоит в активации путем фосфорилирования, что напоминает многие реакции, приведенные в гл. 3.

сво&ЪЭный биотип

* + АТР

|нсо,вч

О

О

Л

СН3ООС—N NH

гвязонный с ферментом биотин

|нсО,в + атр

ООС—IT ^NH

О

О

е

соо

СООСНз

1-n с выхрвом %%

+

У-N свыховом 6%

расцепление ' ООС—N NH

CONH

—1

СО—Lys

|биотиниВаза

CH.Nj

О

в • I

ООС—N NH

е СОО

4- Lys

Рис. 7.16. Идентификация центра карбоксилирования в свободном и связанном с ферментом биотине [343].

Химия коферментов 475

Теперь, объективно рассмотрев все три механизма, которые огласуются с экспериментальными данными, коснемся наиболее важной проблемы функционирования биотина. В последние годы |возникли противоречия относительно локализации в нем центра (связывания карбоксильной группы. При выделении и идентификации сравнительно неустойчивого, особенно при кислых значениях рН,'свободного карбоксибиотина установлено, что при обработке диазометаном он превращается в более устойчивый ди-|метиловый эфир [343, 344]. Это производное впоследствии было [идентифицировано как Г-^метоксикарбонил-(+)-биотинметило-[вый эфир. Тот же самый продукт был также получен в результате протеолитического расщепления связанного с биотином фер-Лента. На рис. 7.16 показаны некоторые из подобных превращений.

ВНа основе описанных экспериментов с использованием различ-

|Чых биотинзависимых ферментов можно сделать вывод, что центр карбоксилирования в биотине—l'-N-атом уреидогруппы, что согласуется также с другими наблюдениями [344]. Однако Брюис и Хегарти [330] показали, что приписываемая l'-N-карбоксилу ^оль активной группы весьма сомнительна. Они считают, что сначала происходит карбоксилирование 2'-0-атома уреидогруппы, но при метилировании, применяемом для выделения карбоксибиотина, О-карбоксилированный продукт может перегруппироваться путем перемещения карбоксильной группы в более термодинами-1 чески устойчивое замещенное при l'-N-атоме уредогруппы произ-'Ьодное биотина.

О О

ео о сн3о/(.о снэо о

I ]Ан ^ -jAh ^o^iAh

^R Ns>"R 0"R

Вопрос состоит в том, что происходит в первую очередь: J N-карбоксилирование [344] или О-карбоксилирование [330] по [наиболее нуклеофильному центру, кислороду мочевины, за кото-|рым следует миграция к азоту? Очевидно, для понимания функциональной роли уреидогруппы необходимо использование био-¦эрганических моделей.

¦ 7.4./. Модельные исследования

I Поскольку биотин участвует в реакциях карбоксилирования, I по-видимому, как нуклеофильный катализатор, К>плоу и Ягер [331] использовали в качестве аналога биотина имидазолидон-2. [исследования декарбоксилирования Ы-карбокси-2-имидазолидона

Исслед

1

476

Глава 7

показали, что имидазолидон-анион — плохая уходящая группа. Ионы металлов, таких, как Си (II) или Mg(II), предотвращают декарбоксилирование. Чувствительность карбоксиимидазолидона О к специфическому кислотному катализу является II по-видимому, наиболее удивительным свойством HNNH этого соединения, которое могло бы объяснить \—I тот факт, что карбоксибиотинферментные про-имиоо.золиоон-2, меЖуХОчные соединения неустойчивы. Нейтральная форма, однако, может декарбоксилироваться внутримолеку-лярно через шестичленное переходное состояние.

9 о

hn n—С( -» С02 + hn ne плохо

ГО

,н

о

н

б)(о

hn Y ° с°2 + hn n хорошо

Неудачные попытки ацилировать модельное соединение я-нит-рофенилацетатом, ацетилимидазолом или хлоридом ацетил-3-ме-тилимидазолия также свидетельствует о том, что N-атом уреидо-группы биотина недостаточно сильный нуклеофил. Тем не менее внутримолекулярная модельная реакция, при которой взаимодействующие функциональные группы располагаются рядом друг с другом надлежащим образом, должна гораздо лучше соответствовать ферментативному процессу.

Например, изучена внутримолекулярная нуклеофильная атака нейтральной или отрицательно заряженной уреидогруппы по ацил-содержащим субстратам с уходящими группами разной основности [330]. Было установлено, что, если имеется хорошая уходя-

X = О—Ph—NO,

n4 Н nh2

О

О

^4r"-nh2

О

+ Xе О-атака/»

nh ve I + л. N-атака

N^4>

н

Химия коферментов

477

Ья группа, О-атака предпочтительнее N-атаки. Эти результаты рггверждают предположение об О-карбоксилировании биотина, ри котором образуется сначала «высокоэнергетическое» соеди-1ние типа карбодиимида (изоимид или изомочевина), а затем но быстро перегруппировывается в более устойчивую N-ациль-ую форму.

О

х

СУ^Х о X

X х X

HN VN. , HN NO Х = металл,

амиЗньш—W ^\ W связанный

n R_(3 имионый R-0 ссу&тратом

S N S

изоимиЭ (О-одилмочевина или изомочевина)

Однако, поскольку неизвестна степень участия фермента в ста-¦лизации уходящей группы аниона X в биотинзависимых реак-иях карбоксилирования, нельзя сказать заранее, что произойдет: или N-атака. Ясно, что простые модельные соединения не ¦егда надежные индикаторы активности моделируемых групп Ъоставе фермента [343]. Возможно, связанный с ферментом био-ин реагирует в форме высокоэнергетической изомочевины, поскольку при этом нуклеофильность атома азота повышена.

и

HN^Ssj—СХЭОе + R'OX R-O

к'=фосфат или АГР х =электрофил (н® или ион, металла.)

I Вернемся к исходному вопросу относительно того, является ни постулированный О-карбоксибиотин истинным промежуточным соединением на первой стадии реакции, протекающей с участием биотина. Получены весьма убедительные доказательства, [что на самом деле истинное биохимическое промежуточное соединение— l'-N-карбоксибиотин [332]. С использованием двух кубъединиц ацетил-СоА-карбоксилазы из Е. coli, биотинкарбокси-шазы и карбокситрансферазы * было доказано, что l'-N-карбоксибиотин действует как донор карбоксильной группы (рис. 7.17). Синтезирован Г-Ы-метоксикарбонил-(+)-биотинилацетат (он

[ * Каждая субъединица полиферментного комплекса может использоваться (Отдельно в модельных исследованиях.

jb HN NH

CH2 S—CoA + W

4o,y

малокил-СоА (+№omun(R = COOH)

(+>6iioitiuHUfla4ei№ni(R ¦=» CH2OAc) (+)-5uomuHon(R = CHjOH)

о

x

a оса,

при И»СНлОАс

биотинкарБоксилаза E.ali пцетип-сол

О

X

ADP + Р, • при R = СООН

О

А.

0,С14—N NH

Rxapffonciuiasa [кароокситранс-фераза)

СНз S—СоА +

ацетил-СоА

R

I'-N-t^Cj-KapffoKcunpoujeoilHoe Jnp

он*

jnpuR = CHjOAe

получен

ТПОЛ6К.0

ппооцкт

Л'-пкацили-

рования

Гохаракте-

риэоеан

масс-спехтро-

скопически,

ПМР и "С-ЯМР)

СН302С—N NH

получек рерментативно и служил субстратом Ът карбокситраяс-(реразы из ?. coli

О

а

еО,С—N NH

X.

еО,Си—N NH

Г^-[иС>прйкси-(+)-биотинол

ОАс

r-N-MemoKCUiiap6oHnn-(+)~ Сиогаинилацетат

1- N-KapEoKcu-C+)-o"uomujKW

получен cmmemvvecitu и служит бонором карбоксильной группы для катализируемого карбокситраксфераэоО

перекарбоксилирования ацетил-соА в мало-над-СоА

Рис. 7.17. Подход, использованный для доказательства карбоксилирования биотина по положению N-Г [332].

охарактеризован химически, масс-спектрометрически, а также методами ПМР и 13С-ЯМР). Щелочной гидролиз дает l'-N-карбокси-и-г-)-биотинол. Установлено, что биотинол, восстановленная форма (спирт) остатка валериановой кислоты в биотине, гораздо более эффективен, чем биотин. Авторы также показали, что реакция,