>1 (обмен с сохранением
свн«- свн5он - с6н5о-к+конфигурации)
<0.5 (изоинверсня)
«ВиОН, ТГФ—N(Pr)3
Шестителей в меченном дейтерием 9-метилфлуорене. [309]. Наиболее интересен случай, когда &обм/?Рац < 0,5, т. е. случай рацемизации без обмена. Это имеет место, если X — диметиламид в присутствии основания м-пропиламина в смешанном растворителе
446
Глава 7
грег-бутанол— тетрагидрофуран (вместо метанола). R
CH3,NH3 СН,
R NH3
На основании этих результатов сделан вывод, что дейтерий отщепляется амином и образующийся аммоний-ион остается спаренным с карбанионом ионной связью. Катион необязательно должен оставаться в исходном положении, так как резонанс кольцевой системы обеспечивает делокализацию отрицательного заряда по всем атомам вплоть до кислорода заместителя. В таком случае ионная пара, которая теперь лежит в плоскости кольца, может скользить вдоль планарной структуры или возвращаться в исходное положение, не обменивая дейтерий на протоны растворителя. Для данного процесса Крам предложил название механизм направленной миграции (основание мигрирует вдоль молекулы), чтобы объяснить явление изоинверсии. Заметим, что в метаноле (более сильная кислота, чем трет-бутанол) карбанион гораздо легче протонируется и поэтому его период полупревращения не достаточно продолжителен, чтобы обеспечить процесс направленной миграции.
Следует отметить, что изоинверсия может также происходить не по механизму направленной миграции. Это наблюдалось опять-таки в случае 9-метилфлуорена и грет-бутанола в качестве растворителя, однако вместо м-пропиламина как основания в систему включен пентаметилгуанидин. В пользу другого механизма говорит и тот факт, что нет необходимости в присутствии такого заместителя, как диметиламид. Основание может обеспечить возможность делокализации зарядов при перемещении дейтрона с одной стороны плоской кольцевой системы на другую без обмена с растворителем. Таким образом, дейтрон может присоединяться с любой стороны плоскости, как это показано ниже:
.сн,
"СН,
Химия коферментов 447
После такого короткого экскурса в химию карбанионов можем теперь приступить к рассмотрению моделей, которые Крам и сотр. [использовали для изучения стереохимического выхода на стадиях .переноса протона при биологических реакциях переаминирования, [осуществляемых пиридоксалем [310]. Были изучены следующие модельные системы [311]:
H^Vh I 'BU0H I H*\
СНз D CH, D
(S)-(-)-7-l m+yi-2
снз сн3 сн3" CH3
(S)-(-)-7-3 W-(-)-7-4
H#\ I rBuOH (Dl у HA
СНз C02Et CH3 C02Et
W-(-)-7-5 (S)-(-)-7-6. 1Как можно видеть, все процессы изомеризации стереоспеци-фичны. Проведение реакции в [02Н]-грег-бутаноле способствует ^изотопному обмену и дает возможность контролировать направление реакций.
ИНапример, если исходным соединением является чистый (S)-(—)-7-5, в присутствии основания диазобицикло [4.3.0] нонена {(ДБН) после уравновешивания в течение 811 ч остается <0,5% [оптически чистого 7-5, а 30—60% его превращается в (5)-(—)-изо-[мер 7-6. Этот результат свидетельствует о том, что внутренняя конверсия стереоспецифична и что изомеризация 7-5 ->-7-6 «с фрон-1та» преобладает над изомеризацией «с тыла». Объемистые пиридиновое кольцо и грег-бутильная группа усиливают конформацион-1ную однородность азааллильной системы. Хиральный центр 7-5 [рацемизируется без обмена с растворителем. Это соответствует [явлению изоинверсии по механизму направленной миграции. Ин-[версия, по-видимому, происходит через образование мостика между РЦЗН и пиридиновым ядром:
гн С°2Е?
:N^N:______XlLh^^C
H--C-N^N,Bu
Хиральный центр 7-6, однако, обменивается с сохранением конфигурации; из-за его большого размера обращение невозможно
В заключение отметим, что таутомеризация происходит внутри-молекулярно и что 1,3-смещение протона с «фронта» происходит через азааллильный анион. Однако модель немного отличается от биологической системы тем, что в ней могут протекать конкурентные стереохимические и изотопные реакции. Таким образом, сте-реоспецифичность ферментативных реакций, протекающих с участием коферментов, достигается благодаря апоферментам, в то время как неферментативные модельные реакции не столь стерео-специфичны [310].
Это стереоспецифическое превращение может быть выгодно использовано в случае объемистой аминокислоты, такой, как ь-треонин, для преимущественно асимметрического синтеза моно-дейтерированного пиридоксамина:
Н н t- аминокислота
5-изомер
Для о- и ь-треонина два продукта пиридоксамина дают разные первичные изотопные эффекты в присутствии глутаматоксалоаце-таттрансаминазы.
7.2.3. Самоуничтожающиеся инактиваторы ферментов и аффинные метки
В широком смысле ферменты специфически ингибируются тогда, когда их активный центр блокирован физически и/или химически без значительного изменения остальной молекулы. С целью такого блокирования было разработано множество типов кова-
Химия коферментов 449
|лентных ингибиторов. Основная задача заключается в проведении [химической модификации аминокислотного остатка в активном шентре фермента, приводящей к потере каталитической активности. Наиболее общий подход состоит в синтезе соответствующих по [структуре и химически активных аналогов субстрата изучаемого [фермента. Такие ингибиторы называются необратимыми ингибиторами, специфичными к активному центру, или аффинными метками [[312, 313]. В общем случае аффинная метка имеет активный элект-1рофильный заместитель, который может давать устойчивую кова-[лентную связь с нуклеофильной группой активного центра. С по-[мощью таких реакций можно идентифицировать важную для катализа нуклеофильную группу.
ИПринципы метода можно проиллюстрировать на примере одного ' из первых экспериментов по введению аффинной метки — реакции Ы-тозил-г-фенилаланинхлорметилкетона (ТФХК.) с а-химотрипси-ном [314].
О
ТФХК
His-57 из а-химотрипсино.
¦ Тозилфенилаланиновый остаток моделирует такой субстрат, как метиловый эфир N-тозилфенилаланина, а хлоркетонная группа /(разд. 2.3) действует как электрофил, в котором ион хлора замешается на His-57 активного центра фермента. Аналогично хлорме-Иилкетонный аналог лизина ингибирует трипсин.
I Диизопропилфторфосфат (ДФФ, разд. 4.4)—также необратимый ингибитор активного центра, который блокирует активный Остаток серина в сериновых протеазах. Легко показать, что нитрирование необратимо, поскольку после исчерпывающего диализа |ермент по-прежнему неактивен.
l?. Ser-I9S
UJ а-химо-
Напротив, субстраты, производные диазометилкетона, могут Эффективно использоваться как специфичные к активному центру Ингибиторы тиоловых протеаз. Например, карбобензоксифенилала-Ниновый аналог реагирует стехиометрически с остатком цистеина
1
15 Зак 549
450
Глава 7
в активном центре папаина.
ООО
II • .•¦ II в II
R— С—CH==N=N -> R—С—CH2-pN=N-> R—С—СНа + N2
R = Cbz-Phe ^ S
SH S
* N остаток * папаина в активном центре
Однако специфичные к активному центру ингибиторы имеют два недостатка. Во-первых, это активные молекулы и значительная часть их просто гидролизуется в водной среде. Во-вторых, они могут реагировать неспецифически с другими активными остатками на поверхности белка.
В опубликованных недавно книгах и обзорных статьях можно найти множество примеров ингибиторов, специфичных к активному центру [312, 313, 315]. Помимо химической модификации фермента и аффинного мечения за последние десять лет разработано еще несколько новых методов. Хотя эти методы и не имеют прямого отношения к биоорганическому моделированию ферментов, о них все же следует упомянуть, так как в приложении к биологическим системам с их помощью можно получить полезную информацию К ним относятся введение фотоаффинной метки [316] и использование флуоресцентной спектроскопической линейки [317]. Эти разработанные недавно методы включают в основном биофизические приемы, обсуждение которых выходит за рамки данной книги, но которые важны для лучшего понимания биологических процессов. Получаемая информация может быть ценным руководством к планированию и созданию новых биоорганических моделей биологически важных макромолекул.
В 70-х гг. стало очевидно, что необходимы новые типы ингибиторов с повышенной селективностью. Например, в течение долгого времени считали, что реагенты на карбонильные группы, такие, как гидроксиламин и гидразин, в то же время представляют интерес как ингибиторы пиридоксальфос-фатзависимых ферментов. Хорошо известный пример — это изоникотинилгидразид (изониазид), один из наиболее эффективных лекарственных препаратов против туберкулеза. Очевидно, это соединение _ конкурирует с пиридоксалем за образование гид-
изони зи разона, который блокирует соответствующий фер-
мент киназу. Последний катализирует биосинтез пиридоксальфосфата из пиридоксаля и АТР.
Существует также много природных необратимых ингибиторов ферментов, называемых токсинами. Хорошо известен как токсин ризобитоксин — Р/у-ненасыщенная аминокислота, продуцируемая
Химия коферментов
451
[Rhizobium japonicutn. Этот природный метаболит — высокоспеци-[фичный необратимый ингибитор пиридоксальзависимой р-циста-'тионазы из бактерий и растений [318].
^ транс
носн2—сн—сн2—о—сн=сн—сн—со2н
NH,
NH2
риэобитоксин но2с—СН—CH2—S—сн2—сн,—сн—со2н
I I
NH, NHZ
цистатионин
[Роль р-цистатионазы заключается в деградации цистатионина!
4NH,
н
еООС—С—CHj-t^S—сн2—сн2—сн(^
N
сн,—с—со.
о -nupueam
+ СНО + HS—сн,—сн,—сн
с02
NH3
гомоцистпеик
Ингибитор связывается аналогично, но дальнейшие химические [превращения с