тадии путем одноэлектронного переноса от присутствующего в растворе в каталитических количествах ароматического активатора [300]. Следующая стадия процесса хемилюминесценции — быстрая потеря С02 восстановленным диоксетаноном. И наконец, последняя стадия всей цепи — излучение возбужденного активатора, которое обнаруживается в виде хемилюминесценции. По-видимому, главная особенность реакций хемилюминесценции — образование анионного радикала.

7.1.5. Липоевая кислота

Липоевая кислота (1,2-дитиолан-З-валериановая кислота) широко распространена в микроорганизмах, растениях и животных. Она относится к группе кофакторов, содержащих серу, и в природе действует в паре с тиаминпиро-фосфатом (разд. 7.3). Однако по своему действию липоевая кислота принадлежит к другому классу переносящих электроны кофакторов, основная окис-лительно-восстановительнаи функции которых заключается в воспроизводстве АТР. Кофактор необходим дли синтеза жирных кислот и метаболизма углеводов.

Действительно, в течение долгого времени было общепризнанным, что липоевая кислота представляет интерес как фактор роста, обнаруженный в ряде микроорганизмов. В соответствии с химическими свойствами она может легко восстанавливаться, а восстановленная форма — сноеэ легко окисляться до ли-поевой кислоты.

S—S

липоевая кислота

NaBH.un.U

СООН ' г^иа' 4 6$Г»

HS SH

СООН

ВигиЭролипоевая кислота

Дигидролипоевая кислота — эффективный реагент, восстанавливающий сульфат-ион до сульфит-иона. Сульфат сначала активируется путем образования аденилсульфата, называемого также аденозин-5'-фосфосульфатом (APS).

Химия коферментов

429

Образование липоевой кислоты — энтропийно выгодный процесс, так как оба атома серы находятся в одной и той же молекуле.

?

ноос>

sh sh

0=Se—О—Р—О—А --

/\ ^ I

о к о

е \ е

еысокоэнергетпический

ангидридный

штермебиат

НООС

о

sh S'VAq

+. so32e

Следует учитывать, что пятичленное кольцо липоевой кислоты не планарно, а имеет двугранный угол С—S—S—С, равный 26°. Обычно дисульфиды не 1крашены, а липоевая кислота желтого ^ета, что объясняют напряжением кольца, 'экое напряжение вызвано отчасти отталкиванием электронных пар смежных ^атомов серы, что делает липоевую кислоту Ьучшим окислителем, чем ее менее напряженный аналог с шестичленным кольцом, ¦аким образом, валицо структурно-функцио-Ёальное соответствие между липоевой кис Вотой и ее биологической функцией ¦01].

¦ Наконец, в полиферментном комплексе, [декарбоксилирование а-кетокислот, липоевая кислота находится не в свободной > форме, а ковалентно связана с остатком лизина амидной связью (рис. 7.8).

Свободно поворачивающаяся «ножка» этой простетической группы координируется с другими центрами комплекса, так что эффективность процесса связана с уникальной химической организацией на субклеточном уровне.

¦ В клетке тиоэфир дигидролипоевой кислоты не накапливаетси, но существует в виде соединения с другим серосодержащим коферментом — кофермен-ром А (СоА—SH)—универсальным переносчиком ацильных групп.

НООС

осуществляющем окислительное

О ОН СН3 О О

II III

HS—CH2CH2NHCCH2CH2NHCOCH—С—О—Р—О-Р—о

сн

пйнтотеновая кислота

NH2

.0 он

но—р' г/^о

еО СоА—SH

430

Глава 7

Рис. 7.8. Схематическое изображение ферментного комплекса при окислительном декарбоксилировании пировиноградной кислоты.

Ацетил-СоА — это реально существующая форма «активированного ацетата», при гидролизе которого освобождается 36,9 кДж/моль (8,8 ккал/моль) (гл. 2). Восстановленная липоевая кислота заново окисляется коферментом FAD, присутствующим в комплексе.

О

-С—S SH + CoAS—SH

сн.

1

СН,—С—S—СоА + HS SH

FAD

S—S

+ FADH,

7.2. Пиридоксальфосфат

Пиридоксин, илн витамин В6, — важнейший компонент пищи. Альдегидная форма называется пиридоксалем, а его фосфатный эфир участвует во многих катализируемых ферментами реакциях аминокислот и аминов. Число таких ре-

Химия коферментов

431

акций огромно, и пирндоксальфосфат (пиридоксаль-Р), несомненно, одни из наиболее многосторонне действующих коферментов.

О

ch,nh,

\

ОН

n^ch,

Iho-ch^yVoh но^СН2

I В активном комплексе фосфори/шрован этот гивроксил nupuoOKCUH

пириЭоксаль (пириЗоксол)

Производные витамина В6.

НО

ОН

^n^ch3

пириЗоксамин

Главная особенность механизма действия этого кофермента, которую следует подчеркнуть. — это протонный перенос. При переаминировании [реакция [7-1)], важнейшем процессе метаболизма азота, пиридоксаль превращается в Сиридоксамин.

R—С— Ш2е + R'—СН—С02е

О

eNH,

R—СН—C02e + R'—С—С02е ®NH3 О

лереаминироеание

носн2—сн—со2е —» сн3—с—со2

(7-1) (7-2)

eNH3

серин пируват элиминирование—гиЭратация

ОН

НО,К)-СН2СН2—СН—С02е ¦-> СН,—CH—СН—СОге (7-3)

eNH3 eNH3 гомосеринфосфат треонин элиминирование - гиЭратация

' но2с—СН2СН2—сн—со2в-> Ш2С—СН2СН2—СН2—КН2 -1- соа

eNH3 (7-4) глутаминовая кислота у-аминомасляная кислота

Векарбоксилирование ^ГАМК*

носн2-ш-со2е—> ^с=о + СН-С'02е (7-5}

®NH3 Н eNH3

серин глицин обратная конбенсация

432

Глава 7

R—C-«C02e

(7-6)

n

'NH,

.co2e

сн:

^NHj

-N OH ®NH3

сн—сн—co2

(7-7)

инйол

H

серии

H

триптофан

синтез триптофана

Фактически кофермент пиридоксаль-Р катализирует по крайней мере семь чрезвычайно разных реакций, в которых полностью проявляются его кислотно-основные свойства и способность к таутомеризации.

Может показаться удивительным, что приведенные выше разнообразные реакции требуют присутствия одного и того же кофактора, однако это легко понять, если учесть, что такие реакции обладают определенными общими свойствами. Все они включают образование имина (шиффова основания) между карбонилом альдегидной группы кофактора и аминогруппой субстрата. Пири-доксальфосфат становится электрофильным катализатором, или «стоком» электронов, так как электроны способны смещаться от аминокислоты к кольцевой структуре. Именно такое направление делокализации электронов определяет тип реакции, а в модельных системах часто наблюдается протекание реакции в нескольких направлениях. Таким образом, фермент не только увеличивает скорость, но и задает направление реакции (разд. 7.2.1).

В процессе переаминирования пнридоксаль превращается из промежуточного фермент-имина в субстрат-имин. Доказательством существования имино-группы служит восстановление пиридоксаля боргидридом, которое не дает пи-ридоксина, а указывает на образование ковалентной связи с лизиновым остатком фермента. Для катализа существенно также протоннрование пиридинового кольца.

Какой выигрыш энергии (если он есть) обеспечивает образование шиффова основания между ферментом н коферментом? Связанный с ферментом имин должен обеспечить более быстрый путь протекания реакции, чем связанный с субстратом имин [301]. Таким образом, именно структура определяет более высокую активность иминов по сравнению с соответствующими альдегидами. Более основный азот образует более прочную водородную связь (с подходящим

процесс а: приводит к декарбоксилированию процесс Ь: приводит к переамицнрованню процесс с: приводит к альдольной конденса-

ции и ретроконденсации

Н

Химия коферментов

433

донором водородной связи на поверхности фермента) и протонируется гораздо сильнее, чем кислород. Кроме того, имннный углерод более электрофилен, чем карбонильный углерод; следовательно, он легче атакуется нуклеофилами.

производное Lys

Таким образом, промежуточный фермент-имин способствует быстрому об-1ованию ковалентного промежуточного соединения между субстратом и ко-жрментом.

I Роль фосфата заключается в связывании кофермента с соответствующим «ферментом. В работе [301] выдвинута интересная гипотеза (рис. 7.9), сочено которой фосфатная и метальная группы служат своего рода осью,

434

Глава 7

Рис. 7.9. Гипотетический механизм действия пиридоксальфосфата Взято с изменениями из работы [301]; разрешение получено

вокруг которой пиридоксаль может поворачиваться, образуя фермент-иминные илн субстрат-нмннные ковалеитные структуры.

Поскольку в природе все разумно, то такой механизм действительно может иметь место [301].

7.2.1. Биологическая роль пиридоксальфосфата

Пиридоксальфосфат обладает рядом особенностей, которые делают его великолепным катализатором реакций переаминирования. Во-первых, гидроксильная группа идеально расположена для того, чтобы осуществлять общий кислотный и основной катализ. Будучи внутримолекулярным, такой катализ особенно эффективен. Во-вторых, положительно заряженный азот пиридинового кольца действует как «сток» (акцептор) электронов, понижая свободную энер-

Химия коферментов

435

гию таутомеризации С—Н-связи. Наконец, все его функциональные группы необходимым образом ориентированы относительно фермента.

И Добавление иона металла, такого, как А1(Ш), к неферментативной системе значительно увеличивает каталитическую активность [302]. Ион металла образует комплекс с имином и действует как общий кислотный катализатор.

R—С Ое

НО

Н-^ ^Ni.....А13+

»N^CH

НО

|Было показано, что Си (II) и Fe(III) также могут в значительной степени благоприятно влиять на скорость реакции; выделены даже реально существующие хелатные промежуточные соединения. Ша модельных системах удалось воспроизвести все реакции, ката-[лизируемые Вб-ферментами (за исключением реакций декарбоксилирования): переаминирование, окислительное дезаминирование, элиминирование |3- и у-заместителей и т. д. Синтезированы и [изучены в биологической системе многие аналоги пиридоксаля. ледующие соединения оказались неэффективными:

СНО

ОСН,

чОН

|ффективные катализаторы приведены ниже: СНО

он

'ОН

СН3

5'-йезокси аналог тшрибоксдля

kN^\CHO

СНО

ОН

I Таким образом, важное значение имеет правильная электронная елокализация. Кроме того, необходимо, по-видимому, присутствие идроксильной группы для хелатирования ионов металлов. Инте-есно, что в случае а-фенил-а-аминомалоновой кислоты в

j треонин Рис. 7.10. Превращение гомосеринфосфата в L-треонин [301].

j треонин Рис. 7.10. П