ковалентное соединение) — для систем, не требующих

Цитохромы — это переносчики электронов в процессе окислительного фос-Мшлирования, суть которого состоит в образовании АТР при переносе электро-ов от NADH или FADH2 к молекулярному кислороду. Весь процесс включает ¦сленне субстрата (например, глюкозы). При этом поток электронов прохо-f через компоненты дыхательной цепи (цитохромы) к молекулярному кисло-, который в конечном счете восстанавливается до воды.

414

Глава 7

присутствия иона металла, и ППМ (протон, протон, металл) — для систем, включающих ион металла. Таким образом, флавиновое ядро и по своей структуре, и по электронному строению способствует стабилизации как одно-, так и двухэлектронных переносов в окислительно-восстановительных реакциях.

изоаллоксазиноеая система I-

СН3 СНз

-1

R

О

возможные электрофилъные _центры_

положение ? (тип мочевины) i положение 4 (амиВный тип) ' положение <Оа(амиЭиновый тип)

положение 4а (углерод шиффова основания)

Для осуществления механизма ППК необходимо образование ковалентного соединения между флавиновым коферментом и субстратом для того, чтобы стал возможным перенос электронов от одной молекулы к другой. Поскольку это ионная реакция, то молекула флавина должна иметь электрофильный центр, легко атакуемый нуклеофильным субстратом. При исследовании флавино-вого ядра обнаружены четыре центра, способных подвергаться атаке, среди которых положение 4а, по-видимому, является наиболее электрофильным. Действительно, реакционноспособность возрастает в какой-то степени благодаря индуктивному эффекту прилегающих амидной и амидиновой групп.

Ниже приведено только два примера хорошо изученных реакций с целью показать, что эти превращения происходят по механизму Гамильтона.

Пример Г. превращение спирта в кетон

Химия коферментов

415

г Пример 2: превращение NADH в NAD+

Yynyny°

н®м о

FAD \

О

I /н*

¦n4Vnh

н?о

I

R

NADH

NH,

nh,

R

еинилогичныц

амиЗиний-ион

облаЗает

значительной

резонансной

стабилизацией-

FADH,

V

R

NAD*

[Ясно, что никакого гидридного переноса не происходит, смещается только ¦гон и образуется ковалентное промежуточное соединение между субстратом положением 4а FAD. Гамильтон считает, что биологические окислительно-всстановительные реакции (дегидратации) редко протекают с участием гидрид-рнов (если вообще такой механизм возможен), так как протоны не имеют пектронной оболочки и поэтому движутся гораздо быстрее и более эффективны |оиологических средах [279]. \ Здесь опять для прояснения ситуации необходимы модельные исследования.

) Модель 1. Первые доказательства существования 4а-аддукта получены В следующем модельном соединении [290];

^v^n-f^nh

v ft

Hj0®,O2

¦ Это соединение было получено путем фотоиндуцированного бензилирования ¦флавина феннлацетатом. Образующийся продукт медленно реагирует с кисло-

416

Глава 7

катализа флавопротеинами и что кислород может легко присоединяться по положению 4а, если положение N-5 замещено или протонировано, как это могло бы быть в ферменте.

Несмотря на то что многие модели свидетельствуют об активности положений 4а и атома N-5, на вопрос, где точно находится электрофильный центр во флавинах, пока нет удовлетворительного ответа.

Модель 2. Предполагается, что между NADH и FAD образуется ковалент-ная связь, а предварительно проведенные исследования свидетельствуют о том, что, во-первых, по-видимому, образуется предравновесный комплекс с флави-нами. Во-вторых, согласно теоретическим расчетам, положение N-5 должно быть хорошим электрофильным центром. Поэтому, согласно Брюису [287], замена атома N-5 на углерод также должна приводить к возникновению мощного электрофильного центра с тем преимуществом, что образующаяся новая С—Н-связь более устойчива и не способна обмениваться водородом с растворителем.

Синтезировано следующее флавиновое модельное соединение, которое было введено в реакцию с NADH (в D20, в течение трех суток, в темноте, в атмосфере аргона).

N-СНз зс'ут

Эейтерий совсем не включается

В результате получен продукт восстановления, ие содержащий в положении 5 дейтерия. Отсюда ясно, что осуществляется прямой перенос водорода (двухэлектронный перенос) к положению 5 и что в предравновесном комплексе молекула NADH, вероятно, не располагается вблизи положений 1, 9 и 10. Эти данные противоречат предположению Гамильтона, что такой аналог FAD Действует как гидридный акцептор.

Модель 3. По аналогии был синтезирован 5-деазарибофлавин, который реагировал в присутствии NADH : FAD-оксндоредуктазы [288]. Показано, что этот 5-деаза-аналог функционирует как кофермент, подвергаясь восстановлению в результате прямого переноса водорода от NADH.

рибитол

I

рибитол

1 н г,

ii ТХн

Н О S-Эеазариб'офлабин

н О

т=3н

Скорость восстановления аналога составляла 0,3% скорости восстановления рибофлавина. Несмотря на то что реакция не была абсолютно стереоспецифич-ной, оксидоредуктаза все же отдавала предпочтение /^-изомеру [4-3H]NADH, атакуя 5-деазарибофлавин с /-е-стороны Оказалось, что производное 5-деаза-FAM (называемое кофактором F420) встречается в качестве природного кофак-

I

Химия коферментов 417

тора в анаэробных бактериях, которые образуют СН4 из С02 [289]; это обстоятельство делает исследование аналогичных модельных систем еще более важным.

Г Модель 4. Сейер и сотр. [291] использовали в качестве модели флавина 1,3-диметил-5-(и-нитрофенилимино) -барбитуровую кислоту, и им удалось выделить ковалентное промежуточное соединение при восстановлении этого высокоактивированного нминного субстрата тиолом (метилтиогликолятом или меркап-тоэтанолом).

R = СН2—СН2ОСО—СНЭ R = СН2—СН2ОН

1

I Продукт присоединения тиола детектировался спектрофогометрически, а промежуточное соединение (R=CH2CH2OH) было выделено, и структура его шоказана методом 'Н- и ,3С-ЯМР-спектроскопии. Промежуточное соединение ^ожет быть превращено в дигидропроизводное. Это свидетельствует о том, Ьто присоединение должно происходить по углеродному атому в положении 4а, а не по атому N-5. Таким образом, эти исследования доказывают существование промежуточного продукта присоединения тиола по С-4а—N-5-связи при ^ферментативном восстановлении флавинов и их аналогов тиолами.

\7.1.4. Реакции оксенов

[Многие оксидазы (монооксигеназы) являются РАО-зависимыми и катализируют окисление различных субстратов молекулярным кислородом. Следовательно, FAD-коферменты способны переносить кислород к органическому субстрату. Это еще оддо из IМногочисленных свойств этого кофактора, отсутствующее у NAD+.

щ Флавинзависимые монооксигеназы связывают и активируют кислород, перенося в конечном счете один атом кислорода к субстрату и освобождая второй атом в виде молекулы воды. К реакциям, катализируемым флавинмонооксигеназами, относятся Гидроксилирование п-оксибензоата, окислительное декарбоксилирование салицилата и ряд реакций окисления аминов, осуществляемых посредством аминооксидазной системы со смешанной функ-

14 Зак, 649

418

Глава 7

NADH (или NAD PH)

NAD (unu NADP.*)

r0x

О

Enr- Ю

* H „

"Red

cuBcmpam-O H,0

cycTcrnparri-

OHOHOH

R=-CHaCHCHCHCHaOF-0| для, FMN и FMNHa

NHj,

R=-CH;,CHCHCHCH2OPOPOCHz_ u-^-D Зля FAD ^СНОН OO^ и FADHj

он он

Рис. 7.6. Цикл оксигенации для флавопротеид-зависимых монооксигеназ [293]. Воспроизведено с разрешения D. Dolphin.

цией [292]. Очевидно, названные реакции включают «оксеновый» механизм. Этот термин образован по аналогии с реакциями с участием карбенов и нитренов — двух других электрофильных частиц.

R—C-R R—N R-O карбен нитрен оксен

Одни ферменты в этих реакциях требуют присутствия иона переходного металла, а другие — нет. Упростим нашу задачу и остановимся только на механизмах без участия иона металла.

Одна группа монооксигеназ, для которых точно известно, что ион металла не нужен, требует присутствия в качестве кофактора флавина. Отсутствие потребности в ионах металла означает также, что некоторые стадии реакции с кислородом могут протекать по свободнорадикальному механизму. Однако, поскольку радикалы субстрата очень неустойчивы, то кажется более вероятным, что кислород реагирует с восстановленной формой флавина с образованием промежуточного соединения, которое затем реагирует с субстратом по ионному механизму. В этом случае спины свободных электронов кислорода сохраняются. Цикл оксигенации для флавинмонооксигеназ приведен на рис. 7.6.

В этих аэробных, связанных с флавином монооксигеназах восстановленный флавин FADH2 сначала реагирует непосредственно с кислородом, давая аддукт FADH202. Этот аддукт, по-видимому,

Химия коферментов

419

затем перегруппировывается во флавин-4а-гидропероксид — хороший окислитель, более сильный, чем Н202.

Каким образом молекула флавина активирует молекулярный ислород? Следует понимать, что в данных превращениях кисло-од участвует в виде молекулы в основном, триплетном, состоянии, то время как органические молекулы (флавин) обычно находятся кинглетном состоянии. Однако реакция синглета с триплетом Образованием синглетного продукта — спинзапрещенный процесс! ем не менее ионная реакция кислорода может протекать без образования синглетного кислорода, если он связан в комплекс Ь ионом переходного металла, который имеет неспаренные электроны. Поскольку для функционирования многих оксидаз не тре-Юуется иона металла, то пока ничего нельзя утверждать окончательно, кроме того что радикальный процесс для флавинов прин-шипиально возможен. Фактически присоединение кислорода к ¦восстановленному флавину аналогично реакции кислорода с замененным тетрааминоэтиленом, имеющим сильную электронодонор-рую двойную связь.

т

. /

\т N\ Зиоксетан

\

о

тип мочевинь!

Далее, ароматические соединения (фенол) могут гидроксили-|роваться под действием кислорода в неферментативной системе, содержащей различные восстановленные флавины. Предполагается, что гидроксилирующим агентом является флавингидропе-[роксид, который перегруппировывается путем протонного ¦переноса, давая действите