тивный пцтъ

I (флаеин) (HLADH)

R ОН

RXH cnuP"i

¦ FMN

NADH <

R)*=o кетон

.Чтобы осуществить противоположное действие (окисление ирта в кетон) система должна быть дополнена флавиновым Ьфактором (FMNH2-*-FMN), где кислород восстанавливается о Н202. Целесообразность использования HLADH в качестве хи-юьного окислительно-восстановительного катализатора была.

408

Глава 7

продемонстрирована неоднократно. Вот два примера:

С I / регенерация /_/ / +

nadh,46%-ное А *s»/OH восстановление, 5ч

О

(±>2- нонборнансн

т олько (+н 1 s,2r,4r) -энао оптическая чистота 64% еыхоЗ 39%

(-

-hiras) оптическая чистота 47% еыхоЗ 31%

о он

V~~T"--\ HLADH,20'C,pH7i V --^-А V...........,.....--ч

новление.Нч 1Q -\Т^>

Ш-бицикло [3.2.1]-октпанон-2,

(-)-(15.2S,SS)-3K30

(шрувно получить Йругим путем) оптическая чистота 83% выхой ЗБ%

(-)-(1Я,5Д)

оптическая чистота 17% еыхоЗ 58%

Обе реакции проходят с высокой степенью стереоспецифичности. Такую стереоспецифичность можно объяснить, если применить

Экваториальный еовороо 0оставл)яется за счет Нв, приближающегося с ге-ста-роны петона в (е-ге-направление действия HLADH)

v

• запрещенные позиции

@ нежелательные позиции

О неуВовлетворительные позиции

Рис. 7.2. Модель алмазно-кристаллической решетки для HLADH, впервые разработанная Прелотом [282]. Воспроизведено с разрешения. © 1978 by the American Chemical Society.

модель алмазно-кристаллической решетки Прелога (рис. 7.2) [285].

Совмещая циклогексанон с алмазной решеткой, Прелог разработал ступенчатый анализ катализируемого HLADH восстановления. Позиции от А до D «запрещены»; окислительно-восстановительная реакция не происходит, если при свя-

Химия коферментов

409

с-6

он

(_) (+) -эмс

ис. 7.3. Анализ с помощью модели алмазно-кристаллической решетки стереохимии восстановления энантиомеров 2-норборнанона, катализируемого HLADH. Считается, что указанные ориентации относятся к «спиртоподобным» переходным состояниям, которые, по-видимому, реализуются; при этом Н приближается со стороны е-re (рис. 7.2). Неблагоприятных решеточных взаимодействий не существует, если расположение (+)- или (—)-изомеров соответствует а и б. Реакции восстановления до (+)- или (—)-эндо-спиртов, таким образом, — разрешенные процессы. Образование в основном (+)-энантиомера, по-видимому, происходит 'благодаря тому, что С-4 предпочитает находиться в незатрудненном положении типа а, а не в положении типа б, где он приближается к запрещенному району решетки А, I, С. Противодействие HLADH образованию экзо-спиртов объясняется неблагоприятными взаимодействиями С-6 с решеточными позициями Ли! (соответственно в и г) [282]. Воспроизведено с разрешения. © 1978 by the American Chemical Society.

аывании потенциального субстрата его группа попадает в одно из этих положений. Позиции от Е до G «нежелательны»: если часть групп субстрата занимает [эти позиции, то реакция, возможно, будет идти, но с очень малой скоростью. Позиции за пределами решетки (U) также относятся к нежелательным. Положение I, как было недавно установлено, «неудовлетворительно». По возможности следует избегать размещения в нем группы, однако, если оно все же занято, редакция будет идти, но медленно.

I Вернемся к предыдущим двум примерам. Ориентация энантио-

1ров в более предпочтительных «плоских» позициях алмазно-Кристаллической решетки HLADH позволяет легко объяснить каблюдаемую стереоспецифичность (рис. 7.3 и 7.4).

I Исследовано [282—284] также окисление диоксициклопентена и обнаружено, что HLADH обладает способностью сохранять

вою энантиоселективность, осуществляя региоспецифическое

410

Глава 7

Рис. 7.4. Схематическое изображение ориентации энантиомеров бицикло [3.2.1]--2-октанона в их предпочтительных «плоских» позициях внутри алмазно-кристаллической ячейки HLADH. Приближение Н к карбонильной группе со стороны е-re обеспечивает образование экзо-спиртовой группы, а — ни один из заместителей (+)-изомера не занимает нежелательных позиций. Таким образом, восстановление до (—) -продукта облегчено, б — соответствующая ориентация энантиомерного (—)-кетона. Здесь С-7 вынужден располагаться вблизи неблагоприятной позиции I, и восстановление по этой схеме не является главным. Образование (+)-продукта, следовательно, — относительно медленный процесс [282]. Воспроизведено с разрешения. © 1978 by the American Chemical Society.

Рис. 7.6. Анализ с помощью алмазно-кристаллической решетки региоспецифично-сти циклопентендиола. Решетка, включая нежелательные позиции А, В, G, I и U, изображена штриховыми линиями. Оксиэтильные группы (+)- и (—)-соединений ориентированы так, что уход иро-Я-водорода может происходить со стороны е-re и неблагоприятных взаимодействий с решеткой можно полностью избежать; реакция приводит к наблюдаемым продуктам для (+)-изомера (а) и для (—)-изомера (б), в и г — вторичная спиртовая группа исходных (+)-и (—)-соеди-иений препятствует до некоторой степени уходу водорода в направлении е-ге; метиленовая группа оксиэтильной функции должна атаковать позицию В (+)-изомера (в) или А (—)-изомера (г). При этом окисление гидроксильных групп в положении С-1 невозможно для обоих энантиомеров [283]. Воспроизведено с разрешения. © 1977 by the American Chemical Society.

Химия коферментов

411

кисление только одной из двух незатрудненных гидроксильных упп молекулы.

он

(±)

HLADH, 20°С, рН 9 /^Г"0\ „ /~^№*ОН

<.0%-ноя * \ I__+ \ J,

регенерация \^'ш„^^ окисленного NAD®,

оптическая чистота 49% выход 48%

ОН

(-Н15.2Л)

оптическая чистота 23% выхоа 35%

Это создает выгодную для синтеза комбинацию свойств, ко-¦рые не могут быть воспроизведены в одну стадию традицион-Жми методами химического окисления. Из рис. 7.5 следует, что ¦блюдаемая региоспецифичность соответствует тому, что пред-мазывает модель алмазно-кристаллической решетки активного ентра.

Судя по всему, при анализе или интерпретации поведения Чзстрата в терминах алмазно-кристаллической решетки следует ращаться к жестким молекулярным моделям. Есть надежда, то применение таких моделей для изучения реакций, протекаю-их в присутствии других ферментов и коферментов, привлечет ще большее внимание химиков к использованию ферментов на ¦удных стадиях сложного органического синтеза.

J.3. Химия флавинов

Многие процессы гидрирования — дегидрирования осуществ-Вются коферментом флавинадениндину клеотидом (FAD); при ¦эм два электрона (по аналогии с гидрид-ионом) переносятся т NADH по дыхательной цепи [357]. Флавины — это соедини-Жльное звено между одно- и двухэлектронными окислительно-¦сстановительными системами и цитохромами в дыхательной епи, где кислород в конечном счете восстанавливается до воды. FAD — кофермент, который, как и NAD+, переносит электроны

NH2

он он он

I I I

СН—сн—СН, .

СН/ чсн:

CHav^^/N^N-s^O

сн

О О 5 =

НО ОН

о

рибофлавин (витамин Вг

FMN

FAD

AMP

412

Глава 7

от субстрата, но гораздо более замысловатым путем. Структура FAD была определена в 1935 г. Куном. Впервые механизм его действия был предложен в 1938 г. Варбургом, а его полный синтез осуществлен в 1954 г. Тоддом и сотр. Гидрофильность заместителя у N-10 обеспечивает растворимость FAD в водном растворе белка.

Предполагается, что центром фиксации гидрид-"иона (или двух электронов) из NADH является электрофильный азот N-5 фла-винового ядра.

NADH + FAD NAD® + FADH2

R н®

NH

Сигман показал, что непосредственный гидридный перенос может происходить от NADH (или 4-[2H]-NADH) с использованием ароматического аналога (N-метилакридиниевой соли) [286]. н н н н

X.CONH2 ^\Хч,^\ ^^/CONH2

+ f Т —ч Т 11 + 1

С3Н7 СНз с3н7

Была также проведена реакция с восстановленной молекулой никотинамида, имеющей боковую пропильную цепь. Однако обратная реакция не идет. Реагенты, ингибиторы свободных радикалов, не влияют на скорость реакции; это говорит о том, что механизм скорее ионный, чем радикальный. Однако изотопные эффекты с дейтерированным NADH показывают, что в отсутствие фермента реакция с FAD — не простой бимолекулярный процесс.

Н H Н D D D

„CONH2 j^^CONH2 JK,/CONH2

моль"'-с

к(п

бля потери гивриЙ-иона при СМ:

2040

Химия коферментов

413

Из приведенных выше результатов можно найти, что вторичный изотопный эффект составляет 0,74. Поскольку хорошо известно, что переход углерода из 5/?3-гибридизации в sp2 должен давать значительно более высокий вторичный изотопный (дейтерия) эффект, чем наблюдается в данном случае, то простой бимолекулярный процесс невозможен. Следовательно, для объяснения экспериментальных данных необходимо постулировать образование кинетически важного промежуточного соединения.

¦ Единого механизма для реакций с участием флавина пока еще не существует. Нельзя исключить образование комплекса с переносом заряда, но свободнорадикальное промежуточное соединение также возможно. Следует напомнить, что для флавиновых ферментов обычно требуются ионы металлов, и они могут играть большую роль в механизме. Фактически промежуточное положение, которое флавиновые ферменты занимают в биохимических процессах дыхательной цепи, после никотинамидных кофермен-ов (двухэлектронный процесс) и перед цитохромами * (одно-лектронный процесс) может быть вызвано сложностью флави-овой структуры, допускающей как ионный, так и свободноради-дальный механизмы. I Свободнорадикальные реакции возможны благодаря тому, что \;тема может легко окисляться или восстанавливаться по меха-¦зму одноэлектронного переноса с образованием стабильного ¦?межуточного соединения, называемого семихиноном (стабили-ированного десятью резонансными формами). В этих пленарных "руктурах одно кольцо всегда остается полностью ароматичес-В то же время, если промежуточные соединения имеют не

R

н сР "О. флавиновый раЭикал семихиноновый рабикал

¦шкальную природу, то реакции должны включать гидридный ж>енос или протекать по механизмам ППК или ППМ. Эти два ¦ханизма предложены Гамильтоном [279]: ППК (протон, про-он,