нуклеофил (НгО или т.-) скорее всего будет атаковать это положение, создавая новый .-комплекс иона кобальта с р-углеродом субстрата. I Подводя итоги, можно предположить следующую последова-тьность событий: уход р-заместителя из о-комплекса кобальта, Вгем образование я-комплекса и, наконец, присоединение уходя-\я группы к я-комплексу с образованием нового о-комплекса 1субстратом.

¦ Процесс завершается вторым переалкилированием, которое ре-енерирует исходный кофермент Bi2 и дегидратированный продукт.

СН2—СНО CH2R CH2R

' сн3—СНО

В Следовательно, важнейший промежуточный продукт в химии офермента Bi2 — я-комплекс Со(III)—олефин. Образование этого нтермедиата химически обосновано, так как енол является элек-ронообогащенным компонентом, а металл (трехвалентный Со) — лектронодефицитным.

¦ Аналогичные этому процессы обнаружены при гетерогенной Полимеризации олефинов (разд. 4.1), где хорошо доказано сущест-

ование о-я-комплекса между металлом (TiCl3) и двойной связью.

¦ Еще одно доказательство о-я-перегруппировки в модельной истеме кобалоксима получено с помощью электронообогащенных лефинов, таких, как виниловые эфиры [261, 262]. Как и ожида-жъ, атака я-комплекса нуклеофилом происходит по наиболее по-ржительному углероду (рис. 6.13).

390

Глава 6

1. NaBH4

ОН

I

СН2СНСН2ОН

NaIQ4?oaH.NH3

2. С1СН2СНСН2ОН / Со /

ОН

^ он )

но

I—У рН 9,0

формилметил-кободамин

сн2сно

\ 1. NaBHt f

2. ВгСН2СН

V /0Et

95#-ны«ЕЮН

Рис. 6.13. Четыре различных пути синтеза формилметилкобаламина [263]. Воспроизведено с разрешения. © 1974 by American Chemical Society.

Согласно этой схеме, образование формилметилкобаламина, промежуточного соединения при ферментативном превращении этиленгликоля в ацетальдегид, может происходить четырьмя различными путями.

Для более сложных систем, таких, как превращение р-метил-аспартата в глутамат [реакция (6-18)] и метилмалонил-СоА в сукцинил-СоА [реакция (6-19)], было доказано, что мигрирует самая большая группа:

НООС^Х, *==>* НООСч1СН2Х.СООН (6-18)

CoA-S ^А.соон CoA-S ^CHij^COOH (6-19)

о он

ноос^А ноое~

^соон * ' Y^-соон (6"20)

СНг СН4

Ионы металлов

391

I В первом случае миграция происходит с обращением конфигурации, в то время как во втором случае — с сохранением конфигурации.

Для системы превращения метилитаконата в а-метиленглутарат [реакция (6-20)] предложена интересная модель с целью демонстрации миграции акрилатного фрагмента в процессе перегруппи-вки углеродного скелета, приводящей к образованию а-метилен-утаровой кислоты [264].

1Модельное промежуточное соединение кофермента синтезировано в результате реакции витамина Bi2s[Co(I)] с бис-(тетрагид-ропиранил)бромметилитаконатом. При выдерживании в водном растворе модельное соединение образует перегруппированную -метиленглутаровую кислоту наряду с неперегруппированной етилитаконовой кислотой и бутадиен-2,3-дикарбоновой кислотой.

*у^СОО(ТГП)

(снУ^соо(тгп)

Вг

ТГП -шетрагиВропиранил

^СОО(ТГП)

(СН2^соо(тгп)

т

Со"

WCOOH

Hjr соон

аоиен-2.,3-Ларбоноеая кислота ¦ 50%)

Zd/AcOD

wCOOH fcHyCOOH

V"'

D

*н,о

!5*c, в темноте nmMocwCOOH

+ X

ту

D

COOH

!неп&рег№пированньш а-метиленглутаровая кислота лрооукт) (перегруппированный лровцкт»

СмУв) (25%)

| Zn/AcOD

Гппи использован

^^Зля ивентификации. перегруппированного Ч^-СООН проЭукта

Вг

[Поскольку модельная реакция не отводит никакой роли дезо-Ладенозину, а его 5'-метиленовая группа осуществляет перенос во-¦юда во всех кофермент-В^-зависимых миграциях углеродных ато-ов, то важно установить источник вводимого в продукт водорода.

392

Глаза 6

Это осуществляли проведением реакции в 2Н20 и анализом продуктов методами ЯМР и масс-спектрометрии. И перегруппированные, и неперегруппированные продукты содержали дейтерий, а бутадиен-2,3-дикарбоновая кислота не содержала. Местонахождение метки было затем определено восстановлением исходного вещества цинком в Ас02Н.

Таким образом, с помощью этих экспериментов установлено, что связь С—Со в модельных системах гидролизуется путем переноса протона из водного раствора. Следует напомнить, что в соответствующем ферментативном процессе при перегруппировке водородный обмен с водой не происходит из-за присутствия 5'-дезоксиаденозинового остатка. Однако если предположить, что положение дейтерия указывает на местонахождение кобальта до гидролиза, то наличие дейтерия исключительно у ^'-углеродного атома в этом модельном соединении означает, что мигрирующей группой в реакции перегруппировки должен быть остаток акриловой кислоты [264].

Таким образом, на основании полученных результатов следует ожидать, что в процессе катализируемой ферментом перегруппировки мигрирует более сложная группа.

Остается выяснить, действительно ли реализуется этот механизм в природном ферменте. Салем и сотр. [265] предположили, что в перегруппировках кофермента Bi2 преимущественно мигрирует более электроотрицательная группа, что согласуется с изложенным выше [264].

Известно также, что малоновый эфир, замещенный в р-положе-нии кобальтом, может перегруппировываться в соответствующий сукциновый эфир. Чтобы изучить возможную роль металла и лучше смоделировать ферментативный процесс, синтезировали [266] следующий кобальтсодержащий комплекс, в котором «субстрат» ковалентно прикреплен двумя метиленовыми мостиками к плоскому кобалоксиму:

С-с-С-о

/ Он Г \ (СН2)4 2^ 0/*% (СН2)4

о сн3

Облучение метанольного раствора этого комплекса и последующая обработка кислотой привели к продукту перегруппировки с хоро

Ионы металлов

1шим выходом. Это наблюдение дает веские основания предпола [гать, что гемолитическая перегруппировка связанного субстрата в продукт инициируется атомом кобальта.

[ Описанные всесторонние модельные исследования биохимических реакций, катализируемых коферментом Bi2, позволяют сде-Гпать следующие выводы. Во-первых, кофермент В[2 внедряется в неактивированную связь С—Н субстрата. В результате адено-зильная группа кофермента теперь несет атом водорода субстрата, 1 метиленовая группа субстрата (в случае превращения метил-,лалонил-СоА в сукцииил-СоА) оказывается связанной с кобальтом кофермента В12 взамен первоначальной связи Со—С в адено-зил-В12. Во-вторых, перегруппировка происходит внутри молекулы кофермент-В^-субстрата с образованием кофермент-В12-продукта. Наконец, происходит реакция, эквивалентная обратной первой эеакции, в процессе которой снова образуется аденозил-кобальто-зая связь кофермента Bi2 и освобождается продукт реакции, несу-1ий один из атомов водорода.

[Бреслоу и Кханна исследовали [267] различные системы, которые в общих Шах моделируют гомологический распад В^-систем, и обнаружили простые хи-ические превращения, которые достаточно надежно подтверждают наличие стадии с внедрением по неактивированному атому углерода. Они получили дифенил-кобалоксимное соединение, которое при облучении генерирует ожидаемый бен-зильный радикал.

СН

393

Эднако образовавшийся радикал димеризовался без переноса водорода от соседней метильной группы. Тогда внимание было обращено к циклододецильному радикалу — системе, в которой внутримолекулярный перенос водорода к углероду свободного радикала уже был продемонстрирован. В качестве маркера опять рспользовался дейтерий.

Поскольку Bi2s [Со(1)] —мощный нуклеофил, он быстро реагирует с алки-|лиодидом, давая циклододецилкобаламин. При бромировании он образует цик-1лододецилбромид с дейтериевой меткой, распределенной по нескольким углеродным атомам в кольце.

I Таким образом, происходит трансанпулярный перенос водорода вдоль всего [остова молекулы. Поскольку реакцию циклододецилиодида с Bi2 действительно 1нельзя рассматривать как простое замещение у атома углерода (она включает ¦также трансаннулярный перенос водорода путем гемолитической фрагментации), 1то в данном случае мы имеем хороший химический аналог реакций внедрения] I общих для всех процессов, катализируемых коферментом Bi2 [267].

394

Глава 6

Однако убедительного прямого доказательства образования промежуточных углеродных радикалов при химических превращениях кофермента Bi2 в природе все еще нет. По этой причине Кори предложил другой интересный механизм, согласующийся с современными представлениями о металлорганических реакциях [268]. Главная особенность этого механизма — электроциклическое раскрытие корин-кольца кофермента, расщепление единственной ко-валентной связи, соединяющей кольца А и D (рис. 6.10), что, таким образом, объясняет роль боковой цепи корин-системы. Кори считает, что созданная природой такая ковалентная связь в корин-системе вовсе не случайна. Наиболее вероятное гипотетическое объяснение происходящей перегруппировки включает образование кобальт-карбенового комплекса с субстратом.

Подробное изложение и обсуждение этого интересного предположения выходит за рамки данной книги, однако следует заметить, что если это действительно так, то надо заново переосмыслить существование я-комплекса Со при перегруппировках кофермента Вц.

Ферментативные системы, связанные с функцией кофермента B)2, достаточно сложны. В связи с этим имеется несколько сообщений об очистке В 12-зависимых ферментов или В|2-связывающих белков с помощью аффинных сорбентов, обладающих сродством к витамину Bi2. Фактически для очистки ферментов или белков аффинная хроматография широко используется как один из наиболее привлекательных методов [270]. С этой целью был разработан метод синтеза нерастворимого носителя кобаламинсефарозы (рис. 6.14). Этот носитель использован для очистки N-5-метилтетрагидрофолатгомоцистеинкобаламинметилтранс-феразы из Е. coli.

Здесь метиониисинтетаза (апофермент *) связывается с сорбентом и может быть получен в виде холофермента путем элюирования после расщепления угле-

* Согласно классической терминологии, полный комплекс фермент — кофактор называется холоферментом, а белковый компонент без кофактора — апофер-ментом. Апофермеит обычно каталитически неактивен,.

Ионы металлов

395

оос

CN

Со3

ИЬаВНЛчгре