Биологический каталог




Биоорганическая химия

Автор Г.Дюга, К.Пенни

лючает две стадии и предпола гает образование одного ангидридного промежуточного продукте (ацилфермента). На первой стадии Zn(II) в ферменте электро фильно активирует карбонил субстрата, облегчая нуклеофильную атаку остатка глутаминовой кислоты. Уход алкоксигруппы (в случае эфирных субстратов) или аминогруппы ( в случае пептидных субстратов) приводит к образованию ангидридной связи между остатком глутаминовой кислоты фермента и образовавшейся при расщеплении карбоксильной группой. На второй стадии гидролиз этого ангидрида могут катализировать только ионы Zn(II) как единственная оставшаяся каталитическая группа. Хотя при проведении реакции в Н2180 происходит включение 180 в карбоксильную группу глутаминового остатка, предложенный механизм пока еще не доказан, так как промежуточное ангидридное соединение никогда еще не было зафиксировано с помощью реакции с нуклео-филом, например с гидроксиламином.

Следовательно, можно усомниться в правильности этого механизма. Для решения подобной проблемы следует ответить на следующие три главных вопроса, касающиеся механизма действия карбоксипептидазы и металлоферментов в широком смысле.

1. Каким образом ионы металла влияют на гидролиз эфиров и амидов?

2. При каких условиях соседняя карбоксильная группа участвует в гидролизе эфиров и амидов и каков механизм такого участия?

3. Каково влияние иона металла на участие внутримолекулярной карбоксильной группы в гидролизе эфиров и амидов?

Ионы металлов

347

•Ответы на эти вопросы можно получить, изучая модельные си-1мы. Уже получена значительная информация по первому и Ьюрому вопросам; однако третий вопрос вызывает затруднения, связанные с поиском такой системы, где возможно участие карбоксильной группы, с которой ион металла не связан.

Чтобы ответить на эти вопросы, Бреслоу и сотр. предложили интересные системы, гораздо лучше яоделирующие действие карбоксипептидазы [220, 221]. Они изучали гидролиз ангидридных моделей в присутствии ионов Zn(II) и определили |коистанты скорости гидролиза псевдопервого порядка при рН 7,5 (табл. 6.1). Следовательно, в присутствии Zn (II) скорость гидролиза падает в том же диапазоне рН, что и

I Таблица 6.1. Константы скорости гидролиза ангидридных модельных соединений при рН 7,5 в предположении реакции псевдопервого порядка [220]

X = СООН, Н

Модельная система *набл- с feOTH

Х = СООН -Zn(II) 2,7 • 10~3 1,0

+ Zn(II) 3,0 103

Х = Н -Zn(II) 5,5- Ю-3 2,0

+ Zn(II) 1,5 5- 10s

|пя карбоксипептидазы; в таком случае расщепление ангидридной связи может быть вполне возможной стадией при катализе этим ферментом. Как и в случае карбоксипептидазы А, ион Zn(II) координируется с двумя атомами азота и одной карбоксильной группой. Исследования расщепления ангидридной связи (X = —СООН) гидроксиламином показали, что в отсутствие Zn(II) гидроксиламин является | эффективным нуклеофилом, способным атако-Вть ангидридную группу, но атака не катализируется Zn(II). Напротив, характер зави-I симости скорости гидролиза от рН указывает »а то, что Zn(II) катализирует атаку ангидрида ОН-ионом, а не молекулой воды, и что |этот процесс гораздо быстрее, чем некатали-¦ируемая атака гидроксиламином. Следовательно, связывание Zn(II) с ОН~ (из Н20) делает ион ОН- чрезвычайно эффективным нуклеофилом, с которым не может конкурировать даже такой хороший нуклеофил, как гидроксиламин. Напомним, что на первой стадии действия карбоксипептидазы Zn(II)

348

Глава б

катализирует образование ангидридной связи между Glu-270 ц субстратом, действуя как кислота Льюиса. Данная модель демонстрирует, что он может также катализировать и вторую стадию, доставляя специфический нуклеофил к промежуточно образовавшейся ангидридной связи. Несмотря ни на что, предполагаемый двухступенчатый механизм для карбоксипептидазы А остается наиболее удовлетворительным объяснением всех имеющихся данных.

Вполне возможно, что ионы цинка и другие ионы в металло-протеинах несут двойную функцию. Первая из них — ориентаци-онный, или матричный, эффект, а вторая-—эффект концентрирования (нуклеофила) на участке протекания реакции.

Основываясь на своих собственных исследованиях модельных соединений, Бреслоу предложил второй механизм гидролиза пептидов карбоксипептидазой А, не включающий образования ацил-ферментного промежуточного соединения [221, 222]. По существу, в гидролизе пептидной связи участвуют ион цинка, карбоксильный ион и гидроксильная группа тирозина. Zn(II) по-прежнему играет роль кислоты Льюиса, координируя карбонильный кислород, а карбоксильная группа действует скорее как общее основание. Это можно утверждать, поскольку в присутствии СН3ОН (вместо воды) метанолиз пептидного субстрата не наблюдался из-за неблагоприятной константы равновесия. Таким образом, фермент не может включать метанол в переходное состояние (в реакции, катализируемой в обоих направлениях) ни в случае эфирных, ни в случае пептидных субстратов. Это означает, что для протекания гидролиза необходимо удаление в переходном состоянии обоих протонов молекулы воды.

Итак, согласно предположенному механизму, карбоксильная, группа Glu-270 действует как общее основание, доставляющее нуклеофил — молекулу воды — к карбонилу. В присутствии метанола первая стадия протекала бы просто в обратном направлении. Следовательно, только второе депротонирование может сдвинуть реакцию в прямом направлении, и этот перенос протона должен происходить с участием гидроксильной группы Туг-248, выступающей в качестве мостика между ОН~-группой и азотом расщепляемой амидной связи. Этот механизм дает объяснение упомянутому ранее эффекту «индуцированного соответствия».

Наконец, наиболее дискуссионный вопрос: что является центром связывания С-концевой карбоксильной группы субстрата: Arg-145 или Zn(II)? Механизм Бреслоу допускает, что верно и то, и другое [222]. Действительно, ион Zn(II) связывает карбоксильную группу гидролизованного продукта, которая становится субстратом в обратной или в последующей реакции. Таким образом, можно ожидать, что экзопептидазы имеют два различных центра связывания, находящиеся на расстоянии, соответствующем одному аминокислотному остатку в субстрате,

II) /Rx

r2—С—NH—СН( е j=

ОН , соое

fc>.Glu-270

\ 4COOe--Arg-145

)ок [=

I

\

I /Rl

R2—С—NH—СН' е 1=

I 'I ^COOe--Arg-145

соон ^(/н

/

Zn2+

r2—с-т-мн,—сн( » Is

(1^ ХСОО^-АгЙ45

в нх

1=

''$0111-270 V

СООН

11= *

Tyr-248 \

XZn2+

(О /Ri к

^| + H2N—СН' в в к

R2—С^. NCOO- -Arg-145

^Glu-270

350

Глава 6

Из этих исследований механизма действия карбоксипепти-дазы А можно сделать следующие два вывода: 1) Zn(II), по-видимому, связывается с карбонильной группой эфирных и амидных субстратов и 2) Glu-270 — также участник процесса, причем предполагается механизм как общего основного, так и нуклеофнльного катализа. Существует также строгое доказательство того, что для эфиров и амидов механизмы различны. Следует обсудить также другой возможный механизм действия карбоксипептидазы А, включающий нуклеофильную атаку эфирной или амидной связи субстрата гидроксильным ионом, координированным цинком(II) Такая возможность тщательно изучена [223], в частности, на гидролизе карбоксилзамещенного эфира 8-оксихинолилглутарата в присутствии Zn(II).

Обширные кинетические исследования показали, что при рН > 6 Zn(II) катализирует гидролиз эфира путем внутримолекулярной атаки связанным с металлом гидроксильным ионом или путем ускоряемой ионом металла атаки свободным гидроксилом. Однако при рН < 6 стимулируемая ионом металла ОН~-атака, хотя происходит со значительной скоростью, все же не может конкурировать с внутримолекулярной атакой карбоксильным ионом, приводящей к выделению связанного с ионом цинка 8-окси-хинолина [223].

Что касается механизма действия карбоксипептидазы А, то вопрос заключается в следующем: может ли соседняя карбоксильная группа (Glu-270), действуя как нуклеофил, конкурировать с атакой гидроксилом, катализируемой ионом металла? Приведенная модель по-видимому, свидетельствует о том, что для эфирных субстратов оба механизма могут иметь место при соответствующих значениях рН.

О

о=с

СООН

8-оксихинолин-глитарат

О.

Ионы металлов

351

\ В связи с этим главный вопрос относительно предполагаемого (ферментативного механизма действия карбоксипептидазы А состоит в стерической возможности и способности карбоксильной группы filu-270 эффективно участвовать в нуклеофильной реакции. Фактически доказательство ее участия сейчас уже получено в спект-оскопических исследованиях при температурах <0°С (—60°С) овалентного ацилферментного промежуточного соединения, полученного при гидролизе субстрата О-(трамс-п-хлорциннамоил)-ь-р-фениллактата карбоксипептидазой А [224]. Более того, результаты свидетельствуют о том, что деацилирование промежуточного смешанного ангидрида катализируется связанной с цинком гид-Ьоксильной группой.

6.3. Гидролиз эфиров аминокислот, амидов и пептидов

¦ Общеизвестно, что переходные металлы имеют d-орбитали, которые лишь частично заполнены электронами. В растворе положительно заряженные ионы этих металлов могут легко соединяться с отрицательно заряженными ионами или другими небольшими электронодонорными химическими группами, называемыми лигандами, с образованием сложных ионов. Геометрия комплекса лиганд—металл зависит от природы иона металла. Комплекс может иметь структуру тетраэдра, плоского квадрата, тригональной бипирамиды или октаэдра. При обсуждении комплексов образованных ионами переходных металлов с лигандами, следует обращать внимание, во-первых, на природу связи лиганд — металл и, во-вторых, на геометрию образовавшегося комплекса. Именно эти рракторы влияют на стабильность ионных комплексов.

| Во многих реакциях, катализируемых ионом металла, роль металла гораздо значительнее, так как он может иметь более высокий заряд и довольно высокую концентрацию в водном растворе. Экспериментально установлено, что концентрация ионов металлов в водных растворах может достигать 0,1 моль/л,

страница 59
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89

Скачать книгу "Биоорганическая химия" (8.62Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(19.08.2017)