Биологический каталог




Биоорганическая химия

Автор Г.Дюга, К.Пенни

нта. Гидролиз N.N-алкилированных солей иминоэфиров также про-Мит под стереоэлектронным контролем, и эта реакция была Пользована для изучения механизма гидролиза амидов. Воз-ткно отщепление или ROH, или R2NH.

R

/OR -СГ + ©он ^NR,

OR I

R—С—ОН I

NR,

R'COOR + HNR2 R'CONR2 + ROH

Б этом случае опять-таки для отщепления остатка иеобхо-участие двух антиперипланарных свободных орбнталей

252

Глава л

остающегося гетероатома в образующемся амиде. Если потен-, циально доступна только одна электронная пара, расщепление) проходит без затруднений только после переориентации связен [117]

R..-PO R'^ N.

R'-

R

N-оБращение i

R^ V^NX

поворот с ю

C-OR

+

0

о

po-Q-R

vi* R

R

T R + ROH О

Эта модель приложима к случаю гидролиза амндиых связей протеазами, и было бы удивительно, если бы ферментативный! гидролиз не подчинялся этим принципам.

Данный простой пример приводит к интересным предположи ниям относительно механизмов ферментативных реакций. Происходит ли конформационное изменение субстратного тетраэдрического интермедиата или остатка активного центра фермента1! Очевидно, для решения этой проблемы необходимы биоорганиче-Г ские модели. Такие модели, которые еще только будут созданы,! дадут возможность определить механизм действия протеаз ис-[ ходя из тетраэдрического интермедиата с относительно фиксированной копформацией.

Далее предполагается, что принцип стереоэлектронного кош! роля при гидролизе эфиров и амидов можно широко применять! и в других областях энзимологии, и, следовательно, некоторые) общепринятые принципы катализа потребуют пересмотра.

В работе [118] предпринята попытка объяснить, почему оста! ток пролина в составе пептидной связи устойчив к гидролизу! а-химотрипсииом. Цель исследования состояла в том, чтобь! выяснить, является ли отсутствие реакционной способности слел-f ствием неблагоприятного взаимодействия метиленовых груи пролинового кольца с активным центром фермента, или же Щ образовании фермептсубстратпого комплекса, так же как время последующих стадий изменения структуры связи, имев место стерпческие затруднения, и связаны ли эти стеричесцГ затруднения со структурой пролинового кольца или просто с за-1

Химия ферментов

253

мещеппем амидпого атома азота. Чтобы ответить на эти вопросы, были синтезированы дипептиды — амиды М-ацетнл-ь-фенил-аланил-ь-пролина и ^ацетнл-ь-фенилаланилсаркознна и изучалось их поведение в качестве субстратов а-хнмотрипсина.

О

Г~^-сн2-сн-с-

NH I

пролингшиЭ

CONH,

О

II /СНз

I хсн2

NH | I CONH2

СН3/СЧ> саркоэинамиЭ

Обнаружено, что оба соединения иереакциоппоспособны, но онн оказались хорошими конкурентными ингибиторами специфического субстрата N-Ac-L-Phe-OMe. Это показывает, что онн

254

Глава 4

образуют ферментсубстратпые комплексы нормальной стабильности и что причину отсутствия реакционной способности следует I искать в природе ферментсубстратных взаимодействий, имеющих место при последующих изменениях структуры связи. Другими словами, отсутствие реакционной способности можно попять, рассматривая стереоэлектроиные превращения, приводящие к промежуточному ацилферменту.

Со

Ск~-ч

/ V

сн2 Н

^-•N^rp-H ООС—R Asp-io:

His-57

/ ceh4y h

H

N-обращение

^n"^n: hooc 1=1 I

R

hooc—r

Pnc. 4.7. Механизм стереоэлектропного контроля по Делоншаму прн гидрож вторичных амидов ос-химотрнпснном.

Химия ферментов

255

поворот на 120°

[Ту ^C,H«Y -¦

(~?<Х \~ стерьческ.ое

^/^ii ^отталкивание 'vVfc благоприятствует /Ь=? отщеплению амина

t YC6H4NH,

(2)-ацйлфермент Рнс. 4.7. Продолжение.

Атака транс-пептидной связи гидроксилом Ser-195 а-химо-шпеина приведет к пространственному расположению, изобра-рвшому на с. 253 (внизу). Исходя из принципа микроскопической обратимости, теория ~еоэлектронного контроля предсказывает, что образующиеся Иитали свободной электронной пары гетероатомов должны быть ршерипланарны новой связи углерод—кислород (из Ser-OH ирбонила амидпой группы) илн углерод — азот. Важное об-ительство, которое следует учитывать в этом случае, состоит том, что несвязывающая пара электронов атома азота направ-в сторону растворителя, а N—Н-связь — внутрь активного "а фермента. Чтобы облегчить пространственное восприятие, "тствующне атомы совмещены с контурами грамс-декалина еаешгая область).

256

Глава 4

Если водород в связи N—Н замещен па алкнльпую грушгя как в случае остатка пролина, этот заместитель слишком близко! подходит к имидазольиому кольцу His-57. Следовательно, дипептид, содержащий остаток пролина, не гидролпзуется а-химотрип сипом, потому что стерические затруднения препятствуют образованию тетраэдрического интермедиата.

Что касается механизма реакции ацплпрованпя, стереоэлек! ронпые требования при расщеплении связи углерод—азот и образовании ацилфермента выполнены, однако для расщепления необходимо, чтобы прошло протонированпе атома азота. Общепринято, что имидазольное кольцо в His-57 играет роль прото-нируюшего агента; ситуация, показанная выше, не может реализоваться, поскольку свободная орбиталь уходящего азота направлена в другую сторону.

Считая, что растворитель пе участвует в протопироваиии-1 депротонироваппи, для образования нового интермедиата, в котором ориентация связи N—Н и ориентация свободной орбитали поменялись бы местами, необходимо предположить инверсию ухо' дящего атома азота.

/////////////

Такая инверсия не только сделает возможным прямое про] тонирование уходящего азота в His-57, но и стабилизирует связь С—О (Ser-195), так как последняя будет теперь антиперипи нарна связи N—Н, а не свободной электронной паре. Такое информационное изменение, вероятно, пе может произойти в присутствии остатка пролина.

Делоишам любезно сообщил нам свои собственные взгляды] на механизм, по которому а-химстрипсин и другие серинови протеазы могут гидролизовать вторичные амины при стереоэле! тронном контроле (рис. 4.7). Петков и др. [119], изучая влиянГ уходящей группы на реакционную способность аиилидов при гнд-ролизе, катализируемом а-химотрипсином, пришли к подобно^ же заключению. Кроме того, теория стереоэлектронпого контр была использована в приложении к механизму действия ри(| пуклеазы А, нуклеазы стафилококков и лизоцима [120].

Химия ферментов

«57

Наконец, следует указать, что принцип углового напряжения амидных связей развит также Моком в 1976 г. и использован в приложении к механизму действия карбоксипептидазы А [121]. Он включает поворот амидной связи таким образом, чтобы стало возможным цис- или транс-присоединение нуклеофила и протона по образующимся орбиталям в переходном состоянии. Этот принцип дополняет теорию (Делошнама) оптимальной геометрии тетраэдрического интермедиата в переходном состоянии.

4.7 Иммобилизованные ферменты и ферментная технология

Закончим эту главу примерами из развивающейся технологии, использую-|щей ферменты, присоединенные к твердой матрице, которые применяются для проведения специфических превращений биоматериалов. Используемый фермент присоединяется к полимерному носителю с помощью «мостиковой» молекулы.

••••• Ы

ляды ювые 1элек-няние i гид-эному троля рибо-

Инертный носитель может быть полиуретаном нлн полимером другого типа ибо природным полимером (например, коллаген, легко выделяемый из шкур жн-юткых). Подвижный «мостнк» присоединен к функциональной группе на полиирном геле. Длина мостика — важный параметр, так как свободный конец долин быть способен образовать ковалентную связь с функциональной группой фермента, не влияя на ферментативную активность. Такой фермент, пришитый f патрице, обычно называют иммобилизованным ферментом [122—125]. В отли-tt от широко распространенного метода аффинной хроматографии * в данном !иучае фермент, а ие субстрат ковалентно сшит с твердым носителем. Однако рщнп биоспецифического узнавания тот же.

В обычной аффинной хроматографии для иммобилизации субстратов в ка-1«ове носителей используются агароза и сшитая сефароза. В качестве сшивающего агента обычно выступает BrCN, а мостик образован сс.со-диамином. Эти юлнеахаридные носители подвержены биодеградации, и, следовательно, органн-иккие полимерные гели более удобны в качестве матрицы и допускают более набор химических модификаций. Именно эти причины побудили Уайт-'; дса и сотр. разработать новый метод иммобилизации ферментов в сшитых ор-[шчеенпх полимерных гелях [126]. По своей простоте и универсальности этот иггод превосходит ранее предложенные. Особенно ценен он при иммобилизации ииоатеяьно лабильных ферментов для использования в ферментерах большого [jiuepa при проведении реакций органического синтеза, катализируемых фер-вггами.

-первых, путем нагревания акриламида и N-акрилоксисукцинимида с нни-Ьлором радикальной полимеризации азобиензобутиронитрилом (АИБН) сипте-руется несшитый водорастворимый сополимер, несущий активные эфирные ммы. Реакция этого полимера с сс.со-диамииом, выступающим в роли сшиваю-Irt агента, и с ферментом, который должен быть иммобилизован, приводит к fi-Прим. ред.

•См. книгу Туркова Я. Аффинная хроматография. Пер. с англ.—М.: Мир,

I Зш.Б49

258

Глава 4

иммобилизации фермента и образованию геля. Реакцию с участием ферментов, чувствительных к присутствию кислорода, проводят в атмосфере аргона. В конце обработки для разрушения оставшихся активных групп добавляется лизни.

Важная особенность этого метода состоит в том, что добавление фермента в реакционную смесь во время образования геля сводит дезактивацию фермента к минимуму. Далее, ковалентное присоединение фермента к гелю обеспечивает в некоторой степени защиту от протеаз. Эта процедура проста и универсальна; она может быть прямо использована для многих ферментных систем, а также для иммобилизации целых клеток н органелл. Наконец, гель может быть приспособлен для магнитной фильтрации, если при образовании геля использовать железосодержащую жидкость.

Необходимо представлять, что одной из основных задач в этой области является развитие методов стабилизации фермента в нативной форме Г123]. Значительный прогресс в этой о

страница 44
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89

Скачать книгу "Биоорганическая химия" (8.62Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(24.04.2017)