Биологический каталог




Биоорганическая химия

Автор Г.Дюга, К.Пенни

убстратов — эфиров l-аминокислот [101,1 102].

Субтилизин, сериновая протеаза бактериального происхождения, также проявляет, подобно сс-химотрипсину, обращенную специфичность к D-KCTI [103]. Это предполагает, что оба фермента обладают сходной специфичностью к конфигурации их субстратов. Такая общая специфичность ясно подтверждает близкую структурную аналогию первичных связывающих центров обоих фермен-1 тов, и, более того, она отражает эту аналогию. Близкая структурная аналогия объясняет, каким образом сс-химотрипсин и субтилизин, имеющие абсолютно разное филогенетическое происхождение, в действительности «замораживают» свои субстраты^ в одинаковой активной конформаций.

Работы Силвера и Соуна [104] указывают, однако, на пред! почтительность экваториальной ориентации эфирной группы. Таким! образом, результаты этих исследований привели к существенно различным взглядам на ориентацию (аксиальную или экваториаль-1 ную) карбометоксигруппы d-KCTI и, следовательно, связанного с| ферментом l-APME [104, 105]. Вопрос о том, является ли ориен-| тация этой эфирной группы аксиальной или экваториальной, не| был однозначно решен в исследованиях Нимана и сотр. Причина этого, вероятно, заключается в том, что в большинстве использо-| ванных соединений характерные элементы структуры нормальных| субстратов сс-химотрипсина так сильно изменены, что это вызывает серьезные сомнения в применимости моделей.

n.bh.

ангийрии

BiPhME (соединение Белло)

выделенная

Ь-конфцгирация

I) PCI./CC1.

г) сн.он

.CN

3) Н—С— NHAc.ElOe

CO,El

4) на

[1)ЭЭДХ (

' Я CH.N, \ /)

COOR'CH2R

R' = СН, R = С1

'СН,

= Н

R = С—NHAc ^COjEt

к =. СН—NH3e

Химия ферментов

235

Однако в 1968 г. Белло и Шевалье синтезировали из дифенового ангидрида уникальный фиксированный субстрат 3-метоксикарбо-нил-2-дибензазоцинон-1 [106]. Это бифенильное соединение с 2,2'-мостиком представляет собой аналог метилового эфира N-бензоил-фенилаланина (ВРМЕ).

Было показано, что сс-химотрипсин обладает так называемой первичной оптической специфичностью к этому бнфенильному модельному соединению, т. е. только энантиомер, родственный ь-фенилаланину, гидролизуется ферментом.

Вообще говоря, существуют еще три уровня специфического узнавания субстратов в ферментативном катализе. Давайте рассмотрим пептидную связь в полипептидной цени. Боковая цепь R2 определяет нормальную специфичность фермента. Для а-химотрипсина R2 — это ароматическая боковая цепь, а гидрофобная полость (ароматическая щель) в активном центре предназначена для взаимодействия с аминокислотой, узнаваемой ферментом. Такую избирательность называют первичной структурной специфичностью.

первичная оптическая специфичность (в или L)

О

расщепляемая

СВЯЗЬ

^---NH-CH-

вторичная ''/// Чп11 структурная первичная специфичность структурная

специфичность

NH—R3 /^вторичная

([^структурная ^специфичность

Влияние соседних аминокислотных остатков R] и R3 на определенные участки активного центра также играет важную роль для осуществления необходимых взаимодействий и правильной ориентации субстрата. Это влияние ответственно за вторичную структурную специфичность фермента. Наконец, существует еще третичный уровень структурной специфичности, который кратко ниже обсуждается.

Удивительное свойство бифенильного модельного соединения состоит в том, что в растворе оно существует в двух медленно взаимопревращающихся формах, в которых эфирная группа занимает либо внешнее (экваториальное), либо внутреннее (аксиальное) положение относительно бифенильной системы. а-Химотрипсин проявляет существенную специфичность к 5,5ЭКв-конформеру, тогда как остальные конформеры существенно инертнее к ферменту. Скорость гидролиза и константа Михаэлиса для активного кон-Нюрмера фактически идентичны аналогичным величинам соответствующего нормального субстрата — метилового эфира N-бензоил-фенилаланина.

236

Глава 4

Если с химотрипсином инкубировать раствор чистого ^,5аКс-кон1 формера (в смеси диоксан — вода, 5:95), никакого гидролиза не происходит. Однако в диоксановом растворе этот же коиформер через некоторое время под действием сс-химотрипсина легко гидро-лизуется. Следовательно, при растворении кристаллов R, 5аКс-кон-формера в органическом растворителе происходит постепенная' изомеризация в ферментативно активный конформер.

Из тщательного сопоставления молекулярных моделей мож! но сделать вывод, что соединения Нимана (d-KCTI) и Белло! (5,5экв-конформер) подходят как ключ к замку только в том слу-j чае, когда эфирная группа d-KCTI ориентирована аксиально, нахо-1 дясь в связанном с сс-химотрипсином состоянии (рис. 4.4). По-1 этому, если эфирная группа в соединении Нимана ориентирована! аксиально, соединения Белло и Нимана идентичны на молекулярном уровне. Способность существовать в различных формах делает! соединение Белло лучшей моделью при анализе конформаций суб-, стратов, связанных с сс-химотрипсином.

Важное значение имеет также факт, что R, 5аКс-конформер не только устойчив к действию сс-химотрипсина, но он также не способен ингибировать гидролиз активного 5,5экв-конформера. В противоположность этому было показано, что l-KCTI сильно ингиби-рует химотриптический гидролиз d-KCTI. Подобное конкурентное ингибирование продемонстрировано также и для других энантио-мерных пар субстратов химотрипсина. Чтобы понять такое пове-1 дение, следует уяснить, что два конформера соединения Белло раз-1 личаются в двух важных аспектах: ориентацией карбоксиметиль-ной группы и хиральностью бифенильной системы. Следовательно,

Химия ферментов

237

надо сделать вывод о том, что в реакциях с фиксированными субстратами ос-химотрнпсин проявляет способность к специфическому узнаванию молекулярной асимметрии. Это называется третичной структурной специфичностью. Таким образом, специфичность бнфеннльных соединений служит развитию представлений о том, что соответствующие субстраты, обладающие жесткой кон-формацией, могут быть весьма полезными инструментами.

о

Рис. 4.4. Стерсомодсли Драйдннга, показывающие, что соединение Нпмана в D-юнфигурацни может быть совмещено с бнфеннльным модельным соединением

Бслло.

Одинакова ли «молекулярная хиральная специфичность» ферментов, имеющих столь различное филогенетическое происхождение, как папанл (тнольная протеаза растений) и субтилизин (сериновая протеаза бактерий)? Фиксированное бифенильное соединение, естественно, весьма удобно для решения этого вопроса, потому что оно представляет собой молекулярный асимметричный аналог ВРМЕ—хорошего субстрата всех трех протеаз. Оказывается, что субтнлнзип ведет себя с бнфенильпымн изомерами точно так же, как a-хнмотрипсин. Однако к папаину и R, SaKc-, и Х^экв-конформеры неактивны. Неактивность соединения к папаину обусловлена цме-конфигурацией ациламндной части субстрата. Для папаина, вероятно, требуется трансоидная конфигурация вокруг амидной связи, чтобы прошел гидролиз субстрата. Однако ситуация не столь проста, поскольку при изучении синтезированных цисоидного и трансоидного 9- и 10-членных лак-тамных аналогов субстрата обнаружено [107], что г/хгн?-нзомеры ие проявляют заметной субстратной активности к трем изученным протеазам.

238

Глава 4

Хотя эти отрицательные результаты несколько разочаровывают (что часто бывает при использовании модельных соединений), они тем не менее позволяют предположить, что реакционная способность отдельного субстрата, видимо, определяется в основном конфигурацией расщепляемой связи относительно общей формы молекулы субстрата и решающий фактор для катализа — ориентация расщепляемой связи.

Как уже упоминалось, существует значительная перекрестная специфичность для сс-химотрипсина, папаина и субтилизина. Результаты подобных исследований хиральной специфичности, видимо, прольют свет на новые аспекты эволюционной дивергенции протеаз млекопитающих, бактерий н животных. Кроме того, активация зпмогена, как правило, — это промежуточный этап как в биосинтезе протеаз, так и в самых разнообразных биологических процессах, например коагуляция крови, комплементарные реакции, выработка гормонов, фибрнполиз н т. д. Такой точный и ограниченный протеолиз ферментами с широкой первичной специфичностью также показывает решающую важность третичной структурной специфичности протеаз в их взаимодействиях с природными субстратами [107].

Следует отметить, что параллельно в молекулярной фармакологии существует одна нз ее ключевых проблем — перекрестная специфичность различных классов рецепторов. Лекарственные препараты, обладающие структурными особенностями, необходимыми для действия на определенный рецептор, часто вызывают нежелательные побочные эффекты вследствие взаимодействия с другими сходными участками рецептора. Знание хиральной специфичности отдельного рецептора (где это возможно) помогло бы конструировать лекарственные препараты с повышенной специфичностью к данному рецептору. Можно надеяться, что систематическое изучение хиральной специфичности протеаз поможет обеспечить на более простом уровне более рациональную основу для разработки эффекторов, специфичных к определенным рецепторам, потому что ферментсубстратные взаимодействия в принципе имеют ту же природу. Преимущество протеаз состоит в том, что они менее сложны и более доступны, чем другие, часто трудноуловимые рецепторы.

4.5. Другие гидролитические ферменты

В число наиболее известных гидролитических ферментов, для которых получены сведения о структуре и механизме действия, входят экзопептидаза карбоксипептидаза А (гл. 6), рибонуклеаза А (гл. 3) и лизоцим. В настоящей главе мы рассмотрим химию последнего.

Лизоцим — важный белок, катализирующий гидролиз полисахарида, входящего как основной компонент в клеточные стенки

Химия ферментов

239

екоторых бактерий. Лизоцим состоит из р(1 -*¦ 4)-сшитых чередующихся звеньев N-ацетилглюкозамнна (NAG) и N-ацетилмура-иовой кислоты (NAM) (рис. 4.5).

Молекула этого фермента не очень большая: его полипептидная цепь включает 129 аминокислот. Лизоцим — первый фермент, труктура которого была установлена в 1967

страница 41
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89

Скачать книгу "Биоорганическая химия" (8.62Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(29.04.2017)