p>216

Глава 4

как основание, и как кислота:

сн3о

оси.

При этом наблюдается характерное свойство ферментативного катализа — регенерация катализатора путем обратимой реакции. 2-Ампнофенол, кислотные и основные свойства которого выражены сильнее, чем у а-пиридона, не столь эффективно катализирует эту реакцию. В присутствии 2-аминофенола сопряженный механизм| катализа невозможен.

Другой классический пример [72] полифункционального ка! тализа — гидролиз моносукцинатного эфира гексахлорофена:

Эффект сближения и взаимодействие с гидроксильной rpyrJ поп значительно увеличивают скорость реакции. Точно так же! сравнение соответствующих моно- и диацетатов показывает, что! моноацетат гидролизуется в 500 раз быстрее, чем диацетат, при] рН < 5. Зависимость скорости реакции от рН изображается ко-] локолообразной * кривой, что указывает на протекание внутри-1 молекулярного нуклеофнльного и общекислотного гидролиза. Он] также указывает на участие ионных заряженных частиц с про-1 тивоположными значениями рКа при максимальной активности.

ОАс ОН

С1 С1 Suaiiemam

Cl Cl моноацетат

* Колоколообразная форма зависимости скорости реакции от рН характерц! для кислотно-основного сопряженного катализа.

Химия ферментов

217

Возможно, для понимания функций ферментов наиболее подходит модель бифункционального катализа в водной среде. Одной из первых реакций, для которых было показано значительное увеличение скорости в воде, был гидролиз иминолактоиов. Это исследование выполнено Каннингхемом и Шмиром [73], которые обнаружили, что фосфатный буфер по крайней мере в 200 раз эффективнее имидазольного буфера (хотя оба буфера имеют примерно одинаковое значение рКа) при каталитическом отщеплении анилина.

HN—РЬ НОх Ь1Н—Ph ^ < О + PhNHV

н,о медленно

О

При основных значениях рН можно ожидать предпочтительного образования амида, поскольку амидный атом азота — плохая уходящая группа. Это и наблюдается в имидазольном буфере. Однако в фосфатном буфере бифункциональный катализ приводит к тому, что отщепление анилина становится более предпочтительным.

Ph н

+ H2N—Ph

Подобный катализ наблюдается и для бикарбонатного, и для ацетатного буферов.

Позднее Ли и Шмир [74, 75] изучали похожий механизм бифункционального катализа более детально на примере ациклических нмпдоэфиров. И вновь процесс гидролиза проходил через стадию образования тетраэдрического промежуточного продукта,— стадию, определяющую скорость всего процесса, с последующим расщеплением до конечного амида или эфира:

OEt Cfi Ph

V-Ph rOH хсн3

I

CH3

/ \

CH,

II /ph ? .Ph

j—C-N + EtOH СН,—O—OEt + HNf

NCH, СНш

218

Г лава 4

Таблица 4.1. Гидролиз ациклических нмидоэфиров в различных буферных системах [74, 75]

Буфер Исследуемый интервал рН Отношение скоростей а

нсор 7,49—9,73 290

N—ОН ii СН3С—СНз 7,73-8,85 8700

(X 7,92-8,55 1460

N U Н

НРО;е HAsO29 6,96—9,11 52

7,18-8,82 61

H2AsOf 7,42—8,99 150

о©

| CF3CCF3 1 7,13-8,90 47

1 ОН

Отношение скоростей образования ампнз для бифункционального ката лнзаторз и его монофункционального аналога с тем же pKQ.

В отсутствие буфера выход амида увеличивается с повышением рН. При рН 7,5 образуется 50% амида и 50% эфира. Однако в присутствии различных бифункциональных катализаторов предпочтительно начинает образовываться амин (табл. 4.1). За исключением ацетопоксима, все бифункциональные катализаторы содержат кислотные и основные группы в 1,3-положепии. Циклическое переходное состояние, необходимое для сопряженного перехода протона, должно включать восьмнчленное кольцо, например для фосфата: Гсн 0 - н -О уо "

С РХ

ею' nn -н—С чое / \

Ph СН3 J

После образования переходного состояния происходит разрыв связей с отщеплением анилина и образованием эфира, т. е. путем, аналогичным уже описанному для иминолактонов. Отметим, что, хотя имидазол обладает и кислотными, и основными группами, находящимися в 1,3-положении, циклический переход протона в них невозможен.

Дженкс [76] пришел к выводу, что сопряженный бифункциональный кислотно-основной катализ реализуется редко или во-

Химия ферментов

219

обще не происходит вследствие того, что такое столкновение реагирующего вещества и катализатора маловероятно. Кроме того, бифункциональный катализ не обязательно выгоден в водных средах даже в том случае, когда вторая функциональная группа находится в удобном положении, чтобы принять участие в реакции. Поэтому следует подходить с осторожностью к предположениям о том, что большинство ферментов использует бифункциональный или полифуикциональный катализ. Тем не менее эта идея сыграла ведущую роль в развитии представлений о ферментативном катализе.

4.4. а-Химотрипсин

Эффективность ферментативного катализа просто завораживает, особенно если удается получить кристаллографические данные о структуре и имеются достаточно полные физико-химические сведения о ферментативном механизме действия. В этом отношении наиболее изучен фермент группы сериновых протеаз — а-химотрннспн. Термин сериновая протеаза своим происхождением обязан тому, что ферменты этого класса содержат в активном центре гпдроксильную группу серина, которая проявляет необычную реакционную способность к необратимому ингибитору — диизопропилфторфосфату (ДФФ).

Чн-сг хо-сн

СН' ЧСН3 ДФФ

Высокореакционноспособная связь Р—F легко участвует в реакциях замещения с нуклеофнлами, например гидроксилом се-рннового остатка в активном центре протеолитическпх ферментов. В эту же группу ферментов входят трипсин, тромбин и суб-тилизин.

Механизм действия а-химотрипсина в настоящее время изучен, вероятно, более подробно, чем любого другого фермента. Физиологическая роль этого фермента сводится к катализу гидролиза пептидных связей пищевого белка в кишечнике млекопитающих. Он выделяется поджелудочной железой в виде предшественника— зимогена (химотрипсиногена), состоящего нз единственной полипептидной цепи длиной 245 аминокислотных остатков. Такая неактивная форма необходима, чтобы предотвратить «самопереваривание». Гидролиз трипсином (разрыв пептидной цепи) в двух специфических участках активирует предшественник, приводя к образованию активного а-химотрипснна, в котором три пептидные цепи удерживаются дисульфндными мостиками. Трехмерная структура фермента была определена методом рентгеиоструктур-ного анализа Блоу [77], а механизм действия установлен Хартли и Бирктофтом [78, 79].

220

Глава 4

Рентгеноструктурные исследования показали, что помимо се-рина-195 в активный центр входят также остатки гистидина (His-57) и аспарагиновой кислоты (Asp-102). Другой остаток гистидина (His-40) не участвует в катализе. Фермент обладает специфичностью к ароматическим аминокислотам. Эфиры ароматических аминокислот — хорошие субстраты этого фермента, и для большинства кинетических исследований в качестве субстратов использовались такие эфиры. Фермент расщепляет пептиды, освобождая карбоксильную группу ароматических аминокислот. После образования комплекса Михаэлиса единственный реакционноспо-собный Ser-195 вначале ацилируется, образуя ацилферментное промежуточное соединение с субстратом. Превращение комплекса Михаэлиса в ацилфермент происходит сначала путем образования тетраэдрического интермедиата (разд. 4.4.1), и наконец происходит гидролиз ацилфермента при атаке молекулой воды, так что ацилированный продукт обычно не накапливается.

о

En—ОН + R—С—X

ч.

X-OR'.NHR' R = Phe, Тгр, Tjr

О

•—- En—О—С—R

аццлгрермент

[En—OH-R—СОХ]

комплекс- Михаэлиса

в О

Еп-

Ов

с-х-Д*

R

тетразорический ингпермевиат.

н,0

Еп

-О—С— К

-» En— OH +

Ол

он

тетразорический интермеВиат

НО

С—R

Долгое время считалось, что остаток His-57, действуя как основание, повышает нуклеофильность гидроксильной группы Ser-195, выступая в роли общеосновного катализатора.

Ser-195

Н-10Ч:' His-57

Однако на основе кристаллографических данных для а-химо-трипсина был предложен новый механизм общего катализа, названный системой с переносом зарядов. Он обусловлен взаиморасположением Asp-102, His-57 и Ser-195, связанных водородными мостиками (рис. 4.3).

Полагают, что кислотная группа Asp-102 находится в глубине молекулы, и, видимо, ее уникальное положение относительно необычно поляризуемой системы имидазольного кольца His-57, который в незаряженном состоянии способен нести протон на любом из двух своих атомов азота, является ключом к пониманию активности этого фермента, а также и других сериновых протеаз

Химия ферментов

221

[80). «Спрятанная» группа Asp-102 вызывает поляризацию нмн-дазольного кольца, так как такой спрятанный отрицательный заряд приводит к появлению в соседнем положении положительного заряда. Это позволяет протону мигрировать вдоль водородных связей, так что протон гидроксильной группы Ser-195 способен перейти к His-57. Активный остаток серина превращается в реакционноспособный нуклеофил, который может атаковать расщепляемую пептидную связь.

е\ ( /Ser-195 .О-Н—N Н—О

Asp-102—СС, W V R

I °

рА". - 6,5 -7,0 X = NHR', OR'

Каталитическую активность а-химотрипсина нельзя приписать исключительно наличию системы переноса зарядов. Из рентгено-структурных исследований следуют многие другие факторы, ответственные за каталитический процесс. Было обнаружено девять видов специфических ферментсубстратных взаимодействий, которые повышают эффективность а-химотрппсина. Например, стабилизация тетраэдрического интермедиата, а следовательно, понижение энергетического барьера переходного состояния, сопровождается образованием водородной связи между карбонильной группой субстрата и амидным атомом Ser-195 и Gly-193. В химотрипсиногене эта водородная связь отсутствует. Действительно, уточнение структур химотрипсиногена и а-химотрипсина с помощью рентгеноструктурного анализа показывает различия в расположении каталитической триады в зимогене и ферменте. Это конформационное изменение в общей трехмерной структуре фермента, возможно, вызывает значительные изменения химических с