|
|
Биоорганическая химияи эти потенциально ¦уклеофильные центры могут участвовать в нежелательных побочных реакциях. Кроме того, такое многозарядное соединение [слишком полярно, чтобы можно было проводить его очистку [рбычными методами органической химии, например с помощью [хроматографии на силикагеле. Вместо этого необходимо исполь-[зовать хроматографию на ионообменных носителях, обладающих меньшей емкостью (например, на ДЭАЭ-целлюлозе). Фосфоди-[эфирный метод пригоден для получения веществ лишь в небольших количествах. Однако нейтрализация зарядов путем этерифи-[кации подходящими защитными группами перед фосфорилирова-1нием нуклеозидов устраняет проблемы, упомянутые выше. В этом [случае продуктом реакции конденсации является фосфотриэфир. \Фосфотриэфирный метод позволяет работать с большими количе-[ствамн веществ. Ниже описаны некоторые защитные группы, используемые для блокирования фосфата. 168 Глава 3 2,2,2-Трихлорэтильная группа Введение этой защитной группы в соответствующий фосфорплнрующий агент обычно проводят реакцией 2,2,2-трнхлорэтапола с хлорфосфатом пли хлорфос-фнтом: (С1)ЭС—СН2—ОН + а—Р=0 или а—Р: (С1)3С—СН2—О—Р=0 или (С1)3С—CHj^O—К Именно защищенный фосфорнлирующнй агент н реагирует с нуклеозидами с образованием 3',5'-фосфодиэфирной связи. После завершения реакции трихлор-этильная защитная группа может быть удалена несколькими способами; классический — это обработка цинком, но можно использовать и фторид тетрабутил-аммония: r ^:Zn о CI о=р—о—сн/—^ С—С1 I CI *r' 3',5'-фосфотризфирный продукт CH2C(C1)3 о=р-^Ь о е 4:F ? /С1 о=р—0е + сн2=с а о О r' 0=Р—F I %- промежуточный фторфосфат о= -Р—ОН о К' Напомним, что в неводных растворителях (например, в тетрагидрофуране) фт рид-ион — хороший нуклеофил. Индуктивный (отрицательный) эффект трех ато мов хлора делает трнхлорэтильную группу хорошей уходящей группой. Высоко-реакционноспособный промежуточный фторфосфат разлагается при хроматографии. Его также можно разрушить обработкой гндроксидом натрия. (З-Цианэтильная группа Легкодоступная бариевая соль цианэтнлфосфата — подходящий реагент фосфорилирования нуклеозидов. После образования продукта реакции эту гру можно удалить мягкой щелочной обработкой или обработкой фторид-ион Биоорганическая химия фосфатов 169 В обоих случаях происходит В-элиминирование: 0 О 1 ^ ?CN | 0=Р-б^СН2-ХН^ --> 0=Р-Ое + CH2=CH~CN 6 X о R- ЮН или :F ^R' Следует заметить, что в безводных растворителях фторид-ион является и хорошим нуклеофилом, и сильным основанием. Ароматические группы Получившие широкое распространение ароматические защитные группы вводились в соответствующий фосфорилирующий агент путем взаимодействия фенола или о-хлорфенола с хлорфосфатом: /С1 <|2>-ОН или ¦ <^^>-0—Р=0 m<^J/-q—p==q Как и в случае 2,2,2-трихлорэтнльной группы, удаления защитной группы можно добиться обработкой фторидами или гидроксидом натрия. Очевидно, хлорфенпль-ная группа является лучшей уходящей группой, чем фенильная. Атака фторид-ионом также протекает с промежуточным образование фторфосфата. С1. О—R /С1 °=*\ J—/ —» о=р-ое + а )у-он \:ОНе :Fe I O-R O-R- Нежелательным побочным процессом, происходящим при полинуклеотидном синтезе триэфирным методом (т. е. при синтезе более длинных, чем динуклеотид, олигомеров), является расщепление межнуклеотндных связей. Оно наблюдается в значительной степени при удалении ароматических защитных групп обработкой щелочью либо фторид-ионом: (O-R 0е | OPh | 0=Р > О Р OPh + R— ОН |\ЮН' I О-Р 0 R' расщепление мезкниклео* muoHQu связи 170 Глава 3 Было замечено, что использование оксимов для удаления защитных групп уменьшает расщепление межнуклеотидных связей: о н *в(осноеоние)) 0=р—cP-N^ \ }~^°2 I промежуточный пнгиЗриЭ |н,о .-нитробемйльвоксим r о о=р—0е I Реакция проводится в водном дноксане. Напомним, что благодаря а-эффекту альдоксимы — хорошие иуклеофнлы. В последнее время стала применяться ме-тильная группа, поскольку ее удаление вследствие алкильного расщепления прч обработке сильными нуклеофилами (тнофеиоксид, бутиламин) также уменьшает расщепление межнуклеотидиой связи [365]. Аиилидиая группа Исходя из кислотолабильности фосфамидов, можно предположить, что они окажутся потенциально полезными в качестве защитных групп. И действительно, хорошо известна анилидная защита, которую можно ввести и удалить: о _ о || <0^н„дцгк /=\ ro—р—он * . ro—р—N-\ } иэоамилиигприт, н «_" q пириоин-уксусноя кислота q в в В другом варианте анилидная группа может вводиться в составе несимметричного фосфорилирующего агента. Синтез таких амидохлорфосфатов приобретает О |1 о—р—C1 С'Ч'^Ч'""', r_( )_0_p_N ^_// -C.HjNHjCI8 \_/у н \_/У CI C1 H = H,NOi фосфорилирующий агент, который может реагировать со свободным ^ивроксилом нуклеотива __1Z1 Биоорганическая химия фосфатов значение как способ получения нуклеотидов, меченных радиоизотопами, и днасте-реомеров нуклеотидов *. 3.6.4. Образование фосфодиэфирной связи Как уже отмечалось, для синтеза пептидной связи, циклических нуклеотидов и нуклеозидтрпфосфатов, а также фосфодиэфирной связи требуется совершение определенной работы и, следовательно, затрата энергии. Это находит отражение в величине свободной энергии гидролиза фосфомоно- и фосфодиэфнров, которая равна приблизительно —12,6 (—3,0) и —25 кДж/моль (—6,0 ккал/моль) соответственно. Таким образом, как и в случае аминокислот, возможны два общих подхода. Первый заключается во взаимодействии активированного нуклеотида с соответствующей гидроксильной группой нуклеозида, приводящем к образованию фосфодиэфирной связи. Второй основан на возможности проведения реакции нуклеотида (нуклеозидмонофосфата) с нук-леозидом в присутствии «конденсирующего агента», который активирует фосфат in situ. Аналогичный подход может быть применен для синтеза нуклеотида (нуклеозидмонофосфат, фосфомо-ноэфпрная связь), который будет использован для образования фосфодиэфирной связи. Чаще всего при образовании фосфодиэфирной связи исходят из нуклеозид-З'-фосфата и нуклеозида со свободной 5'-гидроксильной группой. В этом случае фосфорилн-руется более реакционноспособная первичная гидроксильная группа. Хлорфосфаты Фосфорилирование нуклеозида хлорфосфатом аналогично образованию пептидной связи, происходящему при взаимодействии амина с ацилхлоридом. Вероятно, один из простейших таких примеров— реакция рибонуклеознда с хлороксидом фосфора. В соответствующих условиях (трпметил- или трнэтилфосфат в качестве растворителя, 0°С, а затем обработка смесью диоксап — пиридин, комнатная температура) происходит фосфорилирование в основном * Недавно появилось сообщение о синтезе двух дпастереомеров защищенного тимиднн-З'-тиофосфата [366]. Ключевая реакция этого синтеза состоит в следующем: О RO OR' RO OR' RO—P—N—I \ H \-f + OR' R = нуклеотий к' = фосфаггиащитная группа 172 Глава 3 наиболее реакцноиноспособиой (наименее стерическн затрудненной) б'-гпдрокснлыюй группы: носн п основание ^еле™е но-р-осн20 основание нисм2 о В00Ь1 п0СЛе \у ч/ Y у + рос13 репкции ¦ он \^_jf но* он но он -90% Конечно, при взаимодействии с соответствующим образом защищенным нуклеозидом можно фосфорилировать и вторичную гид-роксильную группу: (Ph)3COCH20 Th „роа^о-с (Ph)3COCH20 Th нс? ' d но Замена двух атомов хлора на более объемистые заместители приводит к еще большей избирательности фосфорилирующего, агента. Например, в условиях реакции, при которых хлороксид< фосфора дает смесь продуктов (пиридин в качестве растворителя), дифенилхлорфосфат и ди-(2-грег-бутилфенил)хлорфосфат| приведут к фосфорилированию первичной гндроксильной группы на ~90 и ~100% соответственно: основание / (i* н,/п I НО ОН он НО ОН Такая специфичность к первичной гндроксильной группе показывает, что получение желаемых З'-фосфатов может быть затруднено. Например, дифенилхлорфосфат не реагирует с 2',5'-бис-0-метокситетрагидропираиилуридином в пиридине при комнатной температуре. Свободный З'-гидрокснл в этом соединении слишком экранирован, чтобы реагировать с названным объемистым фосфорилирующим агентом. Однако замена пиридина на более эффективный нуклеофильный катализатор, например 5-хлор-1-| метилимидазол, приведет к образованию продукта реакции. Для синтеза нуклеозидмопофосфатов были изучены и другим дихлорфосфаты. 2,2,2-Трихлорэтил-2-хлорфенилхлорфосфат нашел, по-видимому, наиболее широкое применение для синтеза! нуклеозид-З'-фосфатов. При провеяеппн фосфорилирования в пи-] Биоорганическая химия фосфатов 173 ридине использование 1-мстплимндазола обеспечивает высокую скорость реакции. Это обстоятельство весьма существенно для W0-^ Л I* X V-/ О-л о иг Ху ^ ху f % осн, <~\ $\ осн, но oV^3 JJ PhoXp/o О^У к^О СН' рк/ чо к/0 олигонуклеотидного синтеза, где важное значение имеет быстрое приготовление мономерпых единиц. Ниже приведен пример фосфорилирования 5'-защищенного тимидина. (ОЬС-СИ.О НО сн, | У/0-/0) О—N—/ ОСН2—С(С1)3 Трихлорэтильная группа можег быть избирательно удалена (обработка цинком) с образованием защищенного нуклеозид-З'-фос-фата. Этот последний затем превращается в фосфодиэфир по реакции с соответствующим иуклеозидом в присутствии конденсирующего (связывающего) агента: ROCHio Th НОСН2с. Th ХУ + ХУ II 5 + Е ео—р—о RO , . , I агент ROCH2jQ Th "2 Q Т о 1 II О—P—ОСН2П Th CI RO 174 Глава 3 Заметим, что образование фосфодиэфирной связи нельзя сводить к простому взаимодействию хлорфосфата с 5'-гидроксилом нуклеозида. Этот метод редко используется для образования фосфодиэфирной связи, поскольку такие реакции протекают медленнее, а сама методика синтеза сравнительно сложна. Ниже будет обсуждаться более удобная реакция хлорфосфата одного нуклеозида со вторым нуклеозндом. Альтернативный подход з |
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 |
Скачать книгу "Биоорганическая химия" (8.62Mb) |
[каталог] [статьи] [доска объявлений] [обратная связь] |