и эти потенциально ¦уклеофильные центры могут участвовать в нежелательных побочных реакциях. Кроме того, такое многозарядное соединение [слишком полярно, чтобы можно было проводить его очистку [рбычными методами органической химии, например с помощью [хроматографии на силикагеле. Вместо этого необходимо исполь-[зовать хроматографию на ионообменных носителях, обладающих меньшей емкостью (например, на ДЭАЭ-целлюлозе). Фосфоди-[эфирный метод пригоден для получения веществ лишь в небольших количествах. Однако нейтрализация зарядов путем этерифи-[кации подходящими защитными группами перед фосфорилирова-1нием нуклеозидов устраняет проблемы, упомянутые выше. В этом [случае продуктом реакции конденсации является фосфотриэфир. \Фосфотриэфирный метод позволяет работать с большими количе-[ствамн веществ. Ниже описаны некоторые защитные группы, используемые для блокирования фосфата.

168

Глава 3

2,2,2-Трихлорэтильная группа

Введение этой защитной группы в соответствующий фосфорплнрующий агент обычно проводят реакцией 2,2,2-трнхлорэтапола с хлорфосфатом пли хлорфос-фнтом:

(С1)ЭС—СН2—ОН + а—Р=0 или а—Р:

(С1)3С—СН2—О—Р=0 или (С1)3С—CHj^O—К

Именно защищенный фосфорнлирующнй агент н реагирует с нуклеозидами с образованием 3',5'-фосфодиэфирной связи. После завершения реакции трихлор-этильная защитная группа может быть удалена несколькими способами; классический — это обработка цинком, но можно использовать и фторид тетрабутил-аммония:

r ^:Zn о CI

о=р—о—сн/—^

С—С1

I

CI

*r'

3',5'-фосфотризфирный продукт CH2C(C1)3

о=р-^Ь

о

е 4:F

? /С1

о=р—0е + сн2=с

а

о

О

r'

0=Р—F I

%-

промежуточный фторфосфат

о=

-Р—ОН

о

К'

Напомним, что в неводных растворителях (например, в тетрагидрофуране) фт рид-ион — хороший нуклеофил. Индуктивный (отрицательный) эффект трех ато мов хлора делает трнхлорэтильную группу хорошей уходящей группой. Высоко-реакционноспособный промежуточный фторфосфат разлагается при хроматографии. Его также можно разрушить обработкой гндроксидом натрия.

(З-Цианэтильная группа

Легкодоступная бариевая соль цианэтнлфосфата — подходящий реагент фосфорилирования нуклеозидов. После образования продукта реакции эту гру можно удалить мягкой щелочной обработкой или обработкой фторид-ион

Биоорганическая химия фосфатов

169

В обоих случаях происходит В-элиминирование:

0 О

1 ^ ?CN | 0=Р-б^СН2-ХН^ --> 0=Р-Ое + CH2=CH~CN

6 X о

R- ЮН или :F ^R'

Следует заметить, что в безводных растворителях фторид-ион является и хорошим нуклеофилом, и сильным основанием.

Ароматические группы

Получившие широкое распространение ароматические защитные группы вводились в соответствующий фосфорилирующий агент путем взаимодействия фенола или о-хлорфенола с хлорфосфатом:

/С1

<|2>-ОН или -OH + С1-*=0

¦

<^^>-0—Р=0 m<^J/-q—p==q

Как и в случае 2,2,2-трихлорэтнльной группы, удаления защитной группы можно добиться обработкой фторидами или гидроксидом натрия. Очевидно, хлорфенпль-ная группа является лучшей уходящей группой, чем фенильная. Атака фторид-ионом также протекает с промежуточным образование фторфосфата.

С1.

О—R /С1

°=*\ J—/ —» о=р-ое + а )у-он

\:ОНе :Fe I O-R O-R-

Нежелательным побочным процессом, происходящим при полинуклеотидном синтезе триэфирным методом (т. е. при синтезе более длинных, чем динуклеотид, олигомеров), является расщепление межнуклеотндных связей. Оно наблюдается в значительной степени при удалении ароматических защитных групп обработкой щелочью либо фторид-ионом:

(O-R 0е | OPh | 0=Р > О Р OPh + R— ОН

|\ЮН' I О-Р 0 R'

расщепление мезкниклео* muoHQu связи

170

Глава 3

Было замечено, что использование оксимов для удаления защитных групп уменьшает расщепление межнуклеотидных связей:

о н

*в(осноеоние)) 0=р—cP-N^ \ }~^°2 I

промежуточный пнгиЗриЭ

|н,о

.-нитробемйльвоксим r

о

о=р—0е

I

Реакция проводится в водном дноксане. Напомним, что благодаря а-эффекту альдоксимы — хорошие иуклеофнлы. В последнее время стала применяться ме-тильная группа, поскольку ее удаление вследствие алкильного расщепления прч обработке сильными нуклеофилами (тнофеиоксид, бутиламин) также уменьшает расщепление межнуклеотидиой связи [365].

Аиилидиая группа

Исходя из кислотолабильности фосфамидов, можно предположить, что они окажутся потенциально полезными в качестве защитных групп. И действительно, хорошо известна анилидная защита, которую можно ввести и удалить:

о _ о

|| <0^н„дцгк /=\

ro—р—он * . ro—р—N-\ }

иэоамилиигприт, н «_"

q пириоин-уксусноя кислота q

в в

В другом варианте анилидная группа может вводиться в составе несимметричного фосфорилирующего агента. Синтез таких амидохлорфосфатов приобретает

О |1

о—р—C1 С'Ч'^Ч'""', r_( )_0_p_N

^_// -C.HjNHjCI8 \_/у н \_/У

CI C1

H = H,NOi фосфорилирующий агент, который

может реагировать со свободным ^ивроксилом нуклеотива

__1Z1

Биоорганическая химия фосфатов

значение как способ получения нуклеотидов, меченных радиоизотопами, и днасте-реомеров нуклеотидов *.

3.6.4. Образование фосфодиэфирной связи

Как уже отмечалось, для синтеза пептидной связи, циклических нуклеотидов и нуклеозидтрпфосфатов, а также фосфодиэфирной связи требуется совершение определенной работы и, следовательно, затрата энергии. Это находит отражение в величине свободной энергии гидролиза фосфомоно- и фосфодиэфнров, которая равна приблизительно —12,6 (—3,0) и —25 кДж/моль (—6,0 ккал/моль) соответственно. Таким образом, как и в случае аминокислот, возможны два общих подхода. Первый заключается во взаимодействии активированного нуклеотида с соответствующей гидроксильной группой нуклеозида, приводящем к образованию фосфодиэфирной связи. Второй основан на возможности проведения реакции нуклеотида (нуклеозидмонофосфата) с нук-леозидом в присутствии «конденсирующего агента», который активирует фосфат in situ. Аналогичный подход может быть применен для синтеза нуклеотида (нуклеозидмонофосфат, фосфомо-ноэфпрная связь), который будет использован для образования фосфодиэфирной связи. Чаще всего при образовании фосфодиэфирной связи исходят из нуклеозид-З'-фосфата и нуклеозида со свободной 5'-гидроксильной группой. В этом случае фосфорилн-руется более реакционноспособная первичная гидроксильная группа.

Хлорфосфаты

Фосфорилирование нуклеозида хлорфосфатом аналогично образованию пептидной связи, происходящему при взаимодействии амина с ацилхлоридом. Вероятно, один из простейших таких примеров— реакция рибонуклеознда с хлороксидом фосфора. В соответствующих условиях (трпметил- или трнэтилфосфат в качестве растворителя, 0°С, а затем обработка смесью диоксап — пиридин, комнатная температура) происходит фосфорилирование в основном

* Недавно появилось сообщение о синтезе двух дпастереомеров защищенного тимиднн-З'-тиофосфата [366]. Ключевая реакция этого синтеза состоит в следующем:

О

RO

OR'

RO

OR'

RO—P—N—I \

H \-f

+

OR'

R = нуклеотий

к' = фосфаггиащитная группа

172

Глава 3

наиболее реакцноиноспособиой (наименее стерическн затрудненной) б'-гпдрокснлыюй группы:

носн п основание ^еле™е но-р-осн20 основание

нисм2 о В00Ь1 п0СЛе \у ч/

Y у + рос13 репкции ¦ он \^_jf

но* он

но он

-90%

Конечно, при взаимодействии с соответствующим образом защищенным нуклеозидом можно фосфорилировать и вторичную гид-роксильную группу:

(Ph)3COCH20 Th „роа^о-с (Ph)3COCH20 Th

нс? ' d

но

Замена двух атомов хлора на более объемистые заместители приводит к еще большей избирательности фосфорилирующего, агента. Например, в условиях реакции, при которых хлороксид< фосфора дает смесь продуктов (пиридин в качестве растворителя), дифенилхлорфосфат и ди-(2-грег-бутилфенил)хлорфосфат| приведут к фосфорилированию первичной гндроксильной группы на ~90 и ~100% соответственно:

основание / (i*-*• р

н,/п

I

НО ОН он НО ОН

Такая специфичность к первичной гндроксильной группе показывает, что получение желаемых З'-фосфатов может быть затруднено. Например, дифенилхлорфосфат не реагирует с 2',5'-бис-0-метокситетрагидропираиилуридином в пиридине при комнатной температуре. Свободный З'-гидрокснл в этом соединении слишком экранирован, чтобы реагировать с названным объемистым фосфорилирующим агентом. Однако замена пиридина на более эффективный нуклеофильный катализатор, например 5-хлор-1-| метилимидазол, приведет к образованию продукта реакции.

Для синтеза нуклеозидмопофосфатов были изучены и другим дихлорфосфаты. 2,2,2-Трихлорэтил-2-хлорфенилхлорфосфат нашел, по-видимому, наиболее широкое применение для синтеза! нуклеозид-З'-фосфатов. При провеяеппн фосфорилирования в пи-]

Биоорганическая химия фосфатов

173

ридине использование 1-мстплимндазола обеспечивает высокую скорость реакции. Это обстоятельство весьма существенно для

W0-^ Л I* X V-/ О-л о иг

Ху ^ ху

f % осн, <~\ $\ осн,

но oV^3 JJ PhoXp/o О^У

к^О СН' рк/ чо к/0

олигонуклеотидного синтеза, где важное значение имеет быстрое приготовление мономерпых единиц. Ниже приведен пример фосфорилирования 5'-защищенного тимидина.

(ОЬС-СИ.О

НО сн, | У/0-/0)

О—N—/

ОСН2—С(С1)3

Трихлорэтильная группа можег быть избирательно удалена (обработка цинком) с образованием защищенного нуклеозид-З'-фос-фата. Этот последний затем превращается в фосфодиэфир по реакции с соответствующим иуклеозидом в присутствии конденсирующего (связывающего) агента:

ROCHio Th НОСН2с. Th

ХУ + ХУ

II 5 + Е

ео—р—о RO , . ,

I агент

ROCH2jQ Th

"2 Q Т

о

1 II

О—P—ОСН2П Th CI RO

174

Глава 3

Заметим, что образование фосфодиэфирной связи нельзя сводить к простому взаимодействию хлорфосфата с 5'-гидроксилом нуклеозида. Этот метод редко используется для образования фосфодиэфирной связи, поскольку такие реакции протекают медленнее, а сама методика синтеза сравнительно сложна. Ниже будет обсуждаться более удобная реакция хлорфосфата одного нуклеозида со вторым нуклеозндом. Альтернативный подход з