>е

(загрэвка ДНК) 4- п (dATP, dGTP, dCTP. dTTP)

ДНК-полимсраза|мд5+. -nPPj

(затравка XlHK)-[(dAMP)„-(dGMP)„-(dCMP)„-(dTMP)„]

150

Глава 3

Рис. 3.9. Репликация ДНК-

З'Тидроксил затравки атакуется сс-гтомом фосфора соответствующего (определяемого затравкой) трифосфата, отщепляя при этом пнрофосфат и образуя фосфодиэфирную связь. З'-Гид-роксильная группа вновь присоединенного мономера находится теперь в положении, позволяющем атаковать следующую молекулу трифосфата, так что полимеризация может продолжаться вдоль матрицы. Матрица оканчивается 5'-фосфатом, а новообразованная цепь — З'-гидроксильной группой.

ДНК-полимераза существует в различных формах в зависимости от выполняемых ею функций. Хотя это кажется невероятным, разнообразие форм ДНК-полимеразы обусловлено не субъ-единнчной структурой, по крайней мере в бактериальных ферментах. Были охарактеризованы три различные формы фермента из бактерии Е. coli, которые обозначили как полимераза I, II и III. ДНК-полимераза I выполняет в основном репарирующие функции, тогда как ДНК-полимераза III является ферментом репликации. Функции ДНК-полимеразы II еще не ясны. Ферменты млекопитающих также существуют во множественных формах.

В действительности процесс репликации ДНК более сложен, чем описанный выше. Считается, что примерно двадцать белков участвуют в процессе репликации, в том числе и такие, которые разделяют родительские цепи, присоединяют и удаляют небольшие фрагменты затравок, вырезают неправильно присоединившиеся основания и исправляют поврежденные участки. Кроме того, оказывается, что синтез новой цепи на матрице происходит не как одна непрерывная стадия, но путем синтеза небольших цепей (фрагментов Оказаки), которые затем соединяются друг с другом с помощью фермента ДНК-лигазы. Затравкой этих фрагментов могут служить короткие цепи РНК, позднее заме-

Биоорганическая химия фосфатов

15!

пяемые на ДНК, которые синтезирует ДНК-полимераза I. Следовательно, хотя описанная выше картина в основном верна, реакция нуклеофильного замещения между дезоксииуклеозндтрн-фосфатом и З'-гндроксилыюй группой растущей цепи ДНК, катализируемая ДНК-полнмеразой III, на самом деле весьма упрощенно представляет довольно сложный процесс. Однако более подробное описание выходит за рамки настоящей книги.

Тем не менее следует упомянуть о соединениях, способных ингибировать синтез ДНК, подобно тому как рассматривался вопрос об ингибировании белкового синтеза. Эти соединения имеют большое значение, особенно при разработке проблемы химиотерапии раковых заболеваний. Хотя они н обладают нежелательной способностью неизбнрателыю ингибировать синтез ДНК как раковых, так н нормальных клеток, их ценность обусловлена тем, что при многих формах рака (например, лейкозах) скорость размножения раковых клеток гораздо больше роста нормальных клеток. Подобные препараты могут быть двух категорий: нуклео-зидные и ненуклеозидные аналоги.

Возможно, наиболее известными нуклеознднымн аналогами являются соединения на основе арабинозы: Ага(С) (цитозннарабинознд, l-P-D-арабннофуранознл-цн ни) н Ага(А) ( еннпарабннознл, Э-Р-О-арабннофуранознладенин). Оба соединения превращаются в трифосфаты [Лга(СТР) и Ara(ATP) in vivo] н затем двояким образом воздействуют на ДНК-полнмеразу. Они способны ингибировать ДНК-полнмеразу [например, Ага(СТР) ингибнруст ДПК-полнмеразы II н III], а также могут включаться в новообразованную ДНК. На самом деле Ага(С), но иеАга(А), включается также в РНК. Такая замена в ДНК имеет летальные последствия, поскольку в структуре ДНК возникают небольшие различия, в результате того что цнтознновое основание имеет другой угол поворота вокруг гликозидной связи вследствие стернческого отталкивания от 2'-гндроксильной группы.

О

нб нб

Аг'а(С)(если основание 5-иоа-5'-амино-г.',5-

цитоэин) оиаезоксиириоин Ага(А)(еспи основание= (IAdU) авенин)

Недавно был разработан высокоспецифичный препарат* 5-|(од-5'-амино-2',5'-дидезоксиурнднн (IAdU). Он ннгибнрует репликацию ДНК п вирусе герпеса (тип-1), не затрагивая процесс репликации ДНК в клетках млекопитающих. К сожалению, это соединение не проявляет своих противовирусных свойств к он-когенным (вызывающим рак) вирусам. Тем не менее поиски препаратов со сходной структурой [т. е. 5'-аминоаналогов Ага(С)] могут привести к получению соединения, обладающего необходимой избирательностью действия, механизм которого, по-видимому, функционирует на уровне синтеза трнфосфатов. Только

* Совсем недавно [36] был описан другой препарат — 9-(2-оксиэтоксиметнл-гуаннн, ингибирующнй репликацию вируса герпеса, не затрагивая никаких клеток, инфицированных вирусом. Оказывается, в основе селективности лежит способность препарата фосфорилнроваться (тниидпнкиназой, кодируемой вирусом) до соединений, токсичных к вирусному генетическому материалу.

152

Глава 3

клетки, зараженные вирусом, оказываются способными синтезировать lAdUTP, который затем включается в вирусную ДНК. Такая ДНК будет содержать лабильные фосфамидные связи, которые, видимо, впоследствии нарушают процесс репликации (возможно, понижая устойчивость фосфодиэфнрного скелета).

В число примеров препаратов ненуклеозидной природы, ингибнрующнх синтез ДНК путем связывания с двойной спиралью, входят акридины (например, профлавин) и различные антибиотики (например, мнтоцни С, адрнамицин, дау-номицин). Способность акридинов связываться с ДНК и РНК вызвало их использование в биологии в качестве биологических красителей этих молекул. Связывание осуществляется путем «интеркаляции»; плоская кольцевая система про-флавнна, например, интеркалнрует (протискивается) между парами оснований двойной спирали, образующих стопочную структуру. Можно ожидать, что такой «бутерброд» из ДНК и связанных с ней молекул красителя изменит свою геометрическую структуру (удлинит двойную спираль), что и наблюдается в действительности.

CH,OCONH,

сн3о о он 6

н3с

о-

aepuaMUUUH(R=OH)

0QUHOMUU,Un(R = H)

HO NH2

Сходным образом действуют и антибиотики. Поэтому все три антибиотика обладают противоопухолевой активностью.

Синтез 3',5'-фосфодиэфирной связи в РНК осуществляется так же, как и в ДНК. Опять З'-гидроксильная группа растущей цепи (РНК) атакует соответствующий мономерный трифосфат, как диктуется матрицей, образуя фосфодиэфирную связь с последующим отщеплением пирофосфата. Эта реакция катализируется ферментом РНК-полимеразой. В данном случае матрица — это ДНК, так как генетическая информация, хранящаяся в форме ДНК, передается полимерной РНК (так называемой мРНК). В качестве матрицы служит лишь одна из двух цепей ДНК. Однако для начала синтеза не требуется затравки РНК Фермент просто связывается с определенным участком цепи ДНК,- и отсюда начинается синтез РНК; этот участок называется промотором. Происходящую при этом реакцию можно представить следую-

Биоорганическая химия фосфатов

153

Ьнм образом:

ДНК-матрица + п (АТР, GTP, СТР, UTP) РНК-полимсраза|мд5+, -пРР{

РНК-матрица • [(AMP)-(GMP)-(CMP)-(UMP)1„

В отличие от ДНК-полнмеразы РНК-полимераза состоит из субъединиц.

3.6. Химический синтез полинуклеотидов

Химический синтез полидезоксирнбо- или полирибонуклеоти-|ов —сложная задача [37—39]. Перед химиком снова встают те же проблемы, с которыми он сталкивался в полипептндном син-кзе. Необходимо разработать методы последовательного нара-йивания цепи с исключением статистического присоединения мо-¦эмеров, а также методы введения защитных групп для предот-шащения побочных реакций и достижения высоких выходов па Ьждой из стадий введения защитных групп, конденсации и деблокирования. Проблема подбора защитных групп стоит в на-¦гоящее время, да и раньше, наиболее остро, так как может «требоваться избирательное блокирование одной из двух хими-Ьски почти идентичных группировок. Это, в частности, касается ¦штеза рибонуклеотидов, где часто требуется блокировать одну из вторичных гидроксильных групп (2'-) так, чтобы стало возможным избирательное фосфорилирование соседней вторичной [гидрокснлыюй группы (3'-). В действительности положение защитной группы после блокирования (1,2-цнс-днолыюн группы) ¦ожет меняться. Вполне вероятно, что происходит изомеризация Ькомого 2'-защищенного нуклеозида в нежелательный З'-защн-¦енный пуклеозид, особенно при использовании небольших защитных групп.

НО-1/О основание но о основание

У i тшриВин \ /

(слабое = = *"N основание)

^О: Oj^o « 0. „О ОН

Н

СН3

г'-аиетил-изомер 3'-ацетил-изомер

НО-уО основание Н0^0°,с"оеанце

е е (слабая кислота) \ =

Ь: Ь бН

Н V^Si(CH3)3 (H3Q3Si

Е'-триметилсилильный изомер Э-триметипсилильный цзомер

154

Глава 3

Напомним, что полимерные молекулы, как ДНК, гак и РНК, обладают 3',5'-фосфодиэфирным остовом. Гидроксильные группы сахара п экзоцнклические аминогруппы оснований (если таковые имеются) — вот два потенциально реакцнонноспособных центра, которые необходимо блокировать, чтобы образовалась только искомая связь. Если такое блокирование проведено, то может произойти образование желаемой связи:

Z —ОСН2 * Z —ОСН2

\ 0 основание ' \ Q основание

HO 0--Z ^Р—б 6—Z

ео^

z-och25' _но /носн

з'-монофосфат

основание

\ о основание У \ л щ

to, у Ъ

о о—z Z —О 6—Z

о=р—Ое

ОСН2.5" \ р. основание

Э'>—iv

Z = защитная группа

Z—б О—Z З'.З-фосфовиэфир

Конечно, как и в случае образования пептидной связи, затрачивается определенная энергия, и поэтому необходима активация. Синтез фосфодиэфирнон связи был бы невозможен при простом смешивании фосфорной кислоты с соответствующими защищенными нуклеозидами. Наконец (см. ниже), может потребоваться даже блокирование фосфатной группы. Хотя это не строго необходимо (и не применялось в первых нуклеотидных синтезах), такой метод имеет свои преимущества и в настоящее время наиболее распространен.

3.6.1. Защитные группы гетероциклических оснований

Блокирование аминогруппы аденина, гуанина или цитозина может оказаться необходимым при фосфорилировании для предотвращения образования фосфамидов. В более редких случаях (ос