Биологический каталог




Биоорганическая химия

Автор Г.Дюга, К.Пенни

ктроскопии. Можно представить, что во время псевдовращения две апикальные связи «сближаются» и образуют две новые эквато-

Биоорзаничвская химия фосфатов

125

-риальные связи, тогда как две из трех экваториальных связей (третья остается «нейтральной», т. е. сохраняет постоянную длину в течение процесса; ее называют «осью вращения») «расталкиваются» (удлиняются) и образуют две новые апикальные связи. Ниже изображена схема процесса (стрелки указывают удлиняющиеся или укорачивающиеся связи): экваториальный

А

вращения

Следовательно, вследствие псевдовращения метоксигруппа метилэтиленфосфата может оторваться и уйти.

нф + нго + rV° ^ с/ хосн3

н® + сОэ + СН3ОН

I ?

Гидролиз фосфонатных аналогов проходит исключительно с Раскрытием кольца:

н»/нао_

ОСН,

—он осн.

[Такое направление реакции — следствие четвертого правила, устанавливающего, что электроположительные лиганды находятся [предпочтительно в экваториальном положении, ближе к атому [фосфора, а электроотрицательные лиганды предпочитают занижать аксиальное положение, подальше от атома фосфора. Фос-|фор проявляет свойства неметалла, он обладает слабо выра-[женными электроноакцепторными свойствами и предпочитает [-находиться на удалении от других подобных атомов. Поэтому

126

Глава '3

углеродный атом циклического фосфоната находится в экваториальном положении, а кислородный атом — в апикальном.

X

Н®/НЛ

ОСН,

ho-^i

CHjOj

нс/\>

После образования пеитакоординационный промежуточный продукт не способен подвергаться псевдовращенню, так как при этом атомы углерода и кислорода поменялись бы местами. В результате псевдовращение не может происходить, и единственное направление реакции — прямое замещение молекулой воды.

Ранее уже отмечалось, что гидролиз фосфорорганических соединений представляет собой важный метаболический процесс в организме.

Уделив внимание некоторым механизмам гидролиза, интересно сравнить их с механизмом реакции, происходящей в активном центре некоторых ферментов, катализирующих подобные превращения. Фермент бычья панкреатическая рибонуклеаза А (РНаза А)* (М = 13680, одна полипептидная цепь, состоящая из 124 аминокислотных остатков) катализирует деградацию РНК по дву-стадийному механизму:

пиримидин

/ J

о основание _1_г»_ /-> основание

Н,ОК

f

о=р—

он

о®

(переэтернфнкация с последующим гидролизом пятичленного циклического промежуточного продукта). Фермент расщепляет не каждую фосфодиэфирную связь полимерной молекулы РНК, а атакует цепь лишь в определенных точках. Способность атома1 фосфора подвергаться атаке ферментом зависит от того, пурино-вое или пирнмидиновое основание находится при сахарном остатке, образующем фосфодиэфирную связь своей З'-гидроксильной i

* Основы действия ферментов изложены в гл. 4. Для лучшего понимания действия РНазы А уже на данном этапе можно ознакомиться с разд. 4.1 и 4.2.

Биоорганическая химия фосфатов

12?

основание

Рис. 3.6. Механизм гидролиза РНК, катализируемого рибонуклеазой [24]. Номер аминокислотного остатка указывает его положение в полипептндной (белковой) цепи относительно N-концевой аминокислоты.

группой. Кроме того, место атаки у того или иного основания меняется для ферментов, выделенных из различных источников. Например, бычья панкреатическая РНаза атакует фосфоэфирные связи пиримидинового нуклеозида, присоединенного к остатку фосфорной кислоты З'-связыо. В то же время РНаза из бактерии В. subtilis атакует фосфоэфирную связь пурпнового нуклеозида, присоединенного З'-связыо.

128

Глава 3

Данные, полученные с помощью различных методов исследования, указывают на участие по крайней мере трех аминокислот в построении активного центра рибонуклеазы: двух остатков гистидина и одного остатка лизина. Гидролиз РНК (рис. 3.6) проходит в два этапа: переэтерификация и последующий гидролиз. Отметим, что при физиологических значениях рН одно из двух имидазольных колец протонировано, а второе — нет. Имидазоль-ные кольца функционируют как общеосновной — общекислотный катализатор, а положительно заряженный остаток лизина, вероятно, стабилизирует пентакоординационный интермедиат.

Этот остаток лизина, по-видимому, не участвует в первоначальном связывании фосфоэфира с ферментом [24]. Вместо этого субстрат образует две водородные связи между атомами кислорода фосфатной группы и водородным атомом амидной связи в цепи, а также гидратированным остатком глутамина. Водородные связи увеличивают также электрофильность атома фосфора. Еще одна водородная связь, имеющая важное значение для реакции, образуется между протонированным имидазольным кольцом и атомом кислорода субстрата, который далее отщепляется от атома фосфора. Образование этой водородной связи приводит, помимо связывания, к поляризации электронного облака в направлении, которое облегчит полный отрыв протона от имидазольного кольца в процессе гидролиза субстрата (см. ниже).

Сам механизм гидролиза прост и напоминает механизм гидролиза РНК, катализируемого гидроксидом; отличие состоит в специфическом расщеплении фосфодиэфирных связей с образованием 3' (а не 2')-монофосфатов (рис. 3.7). Однако (с учетом псевдовращения) возможны два стереохимических механизма для каждого этапа реакции, катализируемой ферментом.

Эти два механизма названы линейным и смежным: тип реакции определяется относительной геометрией входящей и уходящей групп в процессе замещения. Согласно положению заместителей относительно плоскости экваториальных заместителей, сте-реохимический механизм называется линейным, если входящая группа (нуклеофил) приближается по одну сторону этой плоскости, тогда как уходящая группа удаляется от другой ее стороны. Напротив, если направление приближения входящей группы (нуклеофила) находится вне плоскости, а уходящая группа располагается в плоскости, то механизм смежный. Согласно правилам отбора, смежный механизм требует псевдовращения, чтобы перевести уходящую группу из экваториального в апикальное положение.

Переэтерификация начинается с того, что непротонированный имидазол в активном центре отрывает протон от 2'-гидроксила (общий основной катализ) субстрата (РНК). Как только образуется алкокси-ион, он становится тем нуклеофилом, который

Биоорганическая химия фосфатов

129

ОСН2 О основание

H,o/V\NoH, О О

линейный смежный Б

Рис. 3.7. Различия между линейным и смежным механизмами гидролиза фос-фоднэфириой спязн. а — первая стадия (переэтерификация) гидролиза РНК, катализируемого РНазой; возможны два стерсохнмнческнх пути: при линейном механизме—прямое замещение, при смежном механизме — только псевдовращеиие; Л — вторая стадия (гидролиз) гидролиза РНК, катализируемого РНазой; также возможны два стереохнмичсских пути: вновь при линейном механизме образование З'-фосфата происходит путем прямого замещения, а при смежном механизме только путем псевдовращення [26].

способен атаковать атом фосфора. Если уходящая группа находится в апикальном положении, она может оторваться, причем одновременно происходит протонирование уходящей группы вторым имидазольным остатком (катионом имндазолия), расположенным под плоскостью трех экваториальных заместителей. Такой линейный механизм предполагает участие двух остатков ги-стидппа, поскольку для нмидазольного кольца, связызающего протон 2'-гидроксплыюй группы, было бы физически невозможно и располагаться под плоскостью, и протонировать уходящую группу (рис. 3.6). Если уходящая группа занимает экваториальное положение, она должна вначале претерпеть псевдовращение, т. е. изменить длину связи. Однако она все еще была бы расположена достаточно близко к входящему 2'-гидроксилу, чтобы прото-нпроваться после псевдовращення тем же остатком имидазола, который отрывает протон 2'-гидроксильной группы от субстрата.

5 Зак 549

130

Глава 3

Такой смежный механизм требует дополнительной стадии (псевдовращения), однако при участии только одного остатка гистидина.

Точно такие же соображения применимы и для случая гидролиза 2',3'-циклофосфата. При этом опять-таки нмидазольное кольцо выступает в роли общеосновного катализатора, отрывая протон от молекулы воды, а уходящая группа протонируется тем же самым (линейный механизм) или вторым (смежный механизм) нмидазольным остатком. Отметим, что после завершения реакции гидролиза активный центр восстанавливает исходную структуру н вновь получаются первоначально непротонирован-иый и протоннрованный имидазольные циклы.

Серией элегантных экспериментов было показано, что оба этапа действия РНазы проходят по линейному механизму. Детально этот механизм изучен Ашером [25, 26].

Ключом к решению этой проблемы явилось использование двух днастереомеров уридин-2',3'-цнклофосфотиоатов. Оба изомера подвергались гидролизу РНазой в среде Н2180. Ниже при-

ведены схемы двух механизмов (смежного, или с сохранением; линейного, пли с инверсией) для изомера А. Поскольку известно, что последующее замыкание цикла с помощью диэтнлхлор-фосфата в пиридине проходит с обращением, стереохимию первого шага (ферментативной реакции) можно определить, выделив эпимерные циклические диэфиры и определяя содержание в них изотопа ,80. Как и ожидалось, 180 отсутствовал в изомере А, использованном в ферментативной реакции, но обнаружен в эпимере В. Следовательно, потеря ,80 нуклеотидом в реакции, происходящей с инверсией, требует, чтобы введение 180 происходило с инверсией. Эти результаты исключают псевдовращение как стадию расщепления связи и помогают определить положение, которое Н20 может занять в моделях, полученных при кристаллографических исследованиях РНазы А.

Аналогичным образом с использованием фосфотноатных аналогов изучалась ДНК-зависимая РНК-полимераза из Е. coli [27].

Ряд других ферментов, катализирующих гидролиз фосфоэфи-ров, также имеет важное биологическое значение. В их число входят циклические пурнновые фосфодиэстеразы (в настоящее время немногое известно о химических механизмах действия их актив-

изомер а

изомер в

Биоорганическая химия фосфатов

131

ноWr нол/°у№ H<>W*

б он оч хо о\ ,Ъ

(сохранение)^ ес^Гу

страница 22
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89

Скачать книгу "Биоорганическая химия" (8.62Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(30.04.2017)