R NRКак недостаток этой защитной группировки следует отметить, что трифтор-ацетильные производные аминокислот легко рацемизуются. Защита удаляется обработкой гидроксидом натрия при комнатной температуре; в этих условиях большинство остальных защитных групп не затрагивается.
Другие защитные группы
Были предложены и другие защитные группы, которые, однако, получили менее широкое применение. Многие из них обладают специфическими свойствами: они уникальны либо по области применения, либо по методам удаления. Например, производные о-нитробеизиловых эфиров используются в качестве фотола-бильиых блокирующих групп для защиты амино- и карбоксильных групп. Такие защитные группы удаляют при освещении (Я > 320 нм).
Металлооргаиическая защитная группа (пеитакарбонил{[метокси(фенил)кар-беи]хром(0)}) была предложена для защиты аминогруппы. Она легко удаляется обработкой трифторуксусной кислотой при комнатной температуре. Аминогруппу можно блокировать также, сульфируя с помощью о-иитрофеиилсульфохлорида. Деблокирование происходит под действием НС1, однако иитрофенилсульфопро-изводиое аминокислоты следует хранить в виде соли, поскольку производное свободной кислоты нестабильно.
2.6.2. Блокирование карбоксильной группы
Если необходимо получить дипептид из двух аминокислот, каждая из которых несет свободную и неактивированную карбоксильную группу, то обработка реагентом, одновременно ак-
Биоорганическая химия аминокислот
77
тивирующим карбоксил и вызывающим образование пептидной связи, приведет к самоконденсации. Последнего можно избежать, блокируя карбоксильную группу одной из аминокислот.
В общем случае это достигается этернфикацией карбоксильной группы, подлежащей защите. Для получения метилового или этилового эфира обрабатывают аминокислоту метанолом или этанолом, насыщенным HCI (этерификация по Фишеру). Однако обычно предпочитают эфиры, гидролиз которых легко провести в мягких условиях. Хотя эфиры омыляются основаниями гораздо легче, чем пептиды (поскольку алкоксиды — лучшие уходящие группы), используемые для этого щелочные условия нельзя применять для деблокирования полипептидов. Использование бензи-ловых эфиров позволяет удалять защитные группы при нейтральных условиях с помощью каталитического гидрирования. Бензи-ловые эфиры синтезируют из кислоты и бензилового спирта в присутствии кислоты или тионилхлорида (который переводит спирт в сульфохлорид, и уже последний замещается кислотой),
СН2ОН
R-< /=ч
о—сн2—4 > + СН3ОН
.либо из цезиевой соли кислоты и бензилбромида, либо переэте-рификацией. При использовании кислотного катализа или реакции переэтерификации равновесие смещают в сторону образования желаемых продуктов, удаляя воду (азеотропная перегонка) гили отгоняя легкокипящий метанол. Использование грег-бутило-рых эфиров, напротив, позволяет удалять защитные группы в слабокислой среде, тогда как в щелочной среде эти группы устойчивы. Соответствующий эфир, который нельзя синтезировать прямо из грег-бутанола из-за стерических затруднений, получают [с помощью газообразного изобутилена в присутствии кислоты ,или путем переэтерификации (взаимодействие с грег-бутилацета-|ом).
9 гн о сн3
CHj и i
R-C-OH+ C=CH2 R-c-O-C-CHj
СНз^ I
сн3
с о
R-C-0H-rCH,-C--O-C(CH,)3 =
II II
=i=s R—С—O—C(CH3)3 + CHj—с—OH
78
Глава 2
Недавно для блокирования карбоксильной группы была использована 2-три-метилсилильная группа. Такой эфир получают, проводя реакцию кислоты с 2-три-метилсилилэтаиолом и днциклогексилкарбодиимидом (ДЦГК; дегидратирующий, или конденсирующий, реагент; см. ниже):
О (Л_к=с=ы-Г)
r-c^ +(Сн3)з-й-сн2сн,он——'
— R-<
О—СН2—СН2—Si—(СН3),
Такую защитную группу удаляют в нейтральных условиях обработкой эфира фторидом. Как показано позднее, фторид широко используется для деблокирования углеводов, несущих силильные защитные группы. В безводных средах фторид-нон — хороший нуклеофил.
.О
R -CCL ^~^ XHj
40-jCH2-^CH2^Si^un
f сн
-- r— C<\ + CH2=CH, + (CH3),Si—f
О 6
В ходе пептидного синтеза защита амино- и карбоксильных групп может оказаться недостаточной. В условиях образования пептидной связи нуклеофильные и другие химически активные боковые цепи аминокислот могут участвовать в нежелательных побочных реакциях. Этого можно избежать, блокируя такие боковые цепи защитными группами, которые должны соответствовать общим требованиям, предъявляемым к защитным группам: введение и удаление в мягких условиях и т. д.
Способы защиты боковых цепей различных аминокислот не обсуждаются в настоящей книге, поскольку они подробно описаны в учебниках и монографиях (см. цитируемую литературу). Более важным представляется знакомство с химическими основами методов блокирования амино- и карбоксигрупп, что позволяет сделать выводы о принципах блокирования боковых цепей. Часто для этого используются одни и те же или весьма похожие защитные группы. В качестве примера рассмотрим блокирование тиогруппы цистеина и аминогрупп орнитина и лизина.
Тиольная группа — сильный нуклеофил; она может быть окислена в дисуль-фидную форму. Поэтому ее следует блокировать в процессе пептидного синтеза. С этой целью можно использовать бензильную защиту, которую вводят обработкой тиола бензнлхлоридом (напомним, что бензильиые группы очень легко подвергаются 5к2-замещению). Бензильные группы чувствительны к гидрогенолизу (CBz-группа, тритильиая группа), и поэтому деблокирование можно проводить
Биоорганическая химия аминокислот
79
с помощью натрия в жидком аммиаке. Менее желательно использовать каталитическое гидрирование, так как катализатор будет отравляться серой, как указывалось ранее.
Та же защитная группа может быть использована для защиты а-, б- (орни-тии) и е- (лнзпп) аминогрупп. Избирательное блокирование аминогрупп, находящихся в боковых цепях, достигается путем предварительного образования хелат-ного комплекса с ионами меди:
H2N-(CH2),
2 H2N-(CH2)-СНГ +Cu(II) -- / Ч...
\ XNH2 / NH2
я = з орнитин ff \
n = 4 лизин О (СН2)П—NH2
Образование хелатных комплексов с нонами различных металлов — общее свойство аминокислот. Поскольку несвязанные электроны а-аминогруппы образуют с металлом координационную связь, лишь аминогруппа боковой цепи способна реагировать с ацилирующим агентом. Затем а-амииогруппу можно освободить, обрабатывая комплекс сероводородом.
2.6.3. Образование пептидной связи
Применение находят два подхода. Первый заключается в переводе аминокислоты с блокированной аминогруппой в активированную форму и проведении реакции с аминогруппой второй аминокислоты. Напомним, что на образование пептидной связи затрачивается работа, поэтому необходима активация. Второй — взаимодействие двух аминокислот (одной с блокированной ами-но-, а другой — с карбоксигруппой) в присутствии конденсирующего реагента, активирующего карбоксил in situ. Остановимся сначала на первом.
Ацилхлориды
Аминокислоты можно превратить в соответствующие ацилхлориды: SOCl2
R—СН— СООН -»¦ R—СН—СО—CI + НС1 + S02 или РОС13
| или РС1 |
NH—Z NH—Z
Z = защитная группа
лученный ацнлхлорид легко реагирует с аминогруппой второй аминокислоты образованием пептидной связи. Однако, поскольку хлор — хорошая уходящая уппа, ацилхлориды легко рацемизуются путем промежуточного образования шактонов (разд. 2.6).
#
80 Глава 2
Ангидриды
Смешанные ангидриды менее реакционноспособны, чем ацилхлориды (худшая уходящая группа), что приводит к меньшей степени рацемизации при их образовании. Синтезировать такие соединения удается, проводя нуклеофнльиую
О II
-О—С—R
атаку карбоксилат-иона аминокислоты на ацилгалогеиид. Растворимость аминокислоты в органических растворителях увеличивается в присутствии органических катионов. Образующийся ангидрид легко реагирует с аминогруппой второй аминокислоты. Однако аминогруппа способна реагировать с одной из двух карбонильных групп, так что может образоваться значительное количество побочного продукта. Этого можно избежать, если синтезировать смешанный ангидрид, нуклеофильная атака которого проходит предпочтительно по одному из двух карбоннлов. К образованию такого ангидрида приводит реакция аминокислоты с этиловым эфиром хлоругольной кислоты. В. этом случае атаке подвергается только одна карбонильная группа как более электрофильная (ко второй карбонильной группе с обеих сторон примыкают два атома кислорода, делокализую-щих свои неподеленные электроны) и худшая уходящая группа. Тем не менее может проходить рацемизация, а синтез ангидридов следует проводить при низкой температуре, чтобы избежать их разложения.
R—СН—
О
NH е\ I °
СГ) T>Et
О О О
II II со/ II /R
R—СН—С—О—С—OEt R—СН—С—NH—СН + EtOH
в
I I ^ I ХОО
NH V Д NH
' ^--H2N—СН—R I
Z | Z
СООв
Ацилазиды
Использование ацилазидов сопровождается меньшей (хотя и незначительно) степенью рацемизации, чем использование ацилхлоридов или ангидридов. Азиды можно синтезировать из ацилхлоридов:
О О
II II R—СН—С—CI + NaNU ———> R—СН—С—N,
-ГчаС! j NH NH
Биоорганическая химия аминокислот
81
Однако это потребовало бы превращения аминокислоты в нежелательный ацил-хлорид, что сделало бы такой синтез бессмысленным. Вместо этого используют реакцию с эфирами аминокислот:
О
R—СН—С—ОСНз
H2N—NH2
О
II
NH
-*¦ R—СН—С—NH—NH2 I
NH
HN02
О II
R—СН— C—N3 I
NH
стабильный
(обычно кристаллический)
Азотистая кислота (источник азотистого ангидрида) — хорошо известный реагент для синтеза азидов. Механизм превращения азидов сходен с механизмом реакции диазотирования первичных аминов азотистой кислотой.
R—С—NH—NH,
О ОН
н II к
¦ R— С—NH—N—N=0
R—С—N—NH=N:
II .TV ^5- R-C-NH-N=NTOH
О
R—С—N=N=N:e
Азиды трудно хранить, а всю работу с ними надо проводить при низких температурах, чтобы предотвратить перегруппировку Курциуса в изоцианаты:
R—С<
