амидная

связь — более прочная связь. Как было указано, аминогруппа одной аминокислоты может ацилироваться карбоксильной группой второй аминокислоты. Амидная связь, которая при этом получается, называется пептидной, а образовавшийся продукт — дипептидом. Белки представляют собой полимеры, в которых мономерные единицы соединены амиднымн (пептидными) связями. Амидная связь, образованная двумя аминокислотами, представляет собой вторичный амид в транс-конфигурации. Свободное вращение вокруг С—N-связи затруднено, так как при этом нарушается перекрывание л-электронов, существующее в резонансных структурах, причем стерически предпочтительна транс-конфнгураиня.

ОШЩЩШ (ЩШЩЩ? е(ЩШ^ЩЩ7

цис /пранс

Структура планарной яр^гибридизованной амидиой (пептидной) связи; свобода вращения цис-тронс-изомеров затруднена энергетическим барьером в 41,8 кДж/моль (10 ккал/моль).

Пептидная связь — прочная связь, и для ее образования необходимо затратить энергию. Смешивание водных растворов двух аминокислот — одной с непротонированнон (потенциально нуклеофильной) аминогруппой и второй с протонированной карбоксильной группой — при комнатной температуре привело бы только к образованию соли. С химической точки зрения карбоксильную группу следует превратить в хорошую уходящую группу. С энергетической точки зрения следует активировать карбоксильную группу для компенсации работы, затрачиваемой при образо-

Биоорганическая химия аминокислот 55

вании пептидной связи. Это находит отражение в величине свободной энергии гидролиза амидной связи, AGr„np «—12кДж/моль (ог —3 до —4 ккал/моль). С другой стороны, для ацилхлорида А^гидр = —29,3 кДж/моль (—7 ккал/моль), причем хлор — хорошая уходящая группа. Таким образом, можно превратить карб-окснгруппу аминокислоты в ацилхлорид (с помощью тионилхлори-да, пентахлорида фосфора) и провести реакцию с аминогруппой второй аминокислоты, приводящую к образованию пептидной связи. На самом деле такой метод представляет слишком упрощенную схему пептидного (белкового) синтеза, и позднее будет описана более усовершенствованная методология. Интересно, однако, сначала разобраться, как происходит синтез пептидной связи в биологической системе, обращая особое внимание на проблему активации карбоксильной группы. Напомним, что и при синтезе химическим путем, и при образовании в организме требуется затратить одну и ту же энергию.

R— С + H2N—R' -> R—С—NH—R' + НО

О 4—"—'

оБраэоватле гегтиВной связи

С биологической точки зрения ангидрид — это структура |с высокой энергией, т. е. это форма хранения потенциальной энергии. (Понятие об высокоэнергетических структурах, а также основные представления о хи- 9 z мин ангидридов можно найти в гл. 3, посвящен- (—с—х—Y—) нон биологическим функциям фосфора.) Любое соединение, представляющее собой ангидрид, обладает AGriinp > > 29,3 кДж/моль (7 ккал/моль). В качестве примеров можно привести уксусный ангидрид, ацетилфосфат, ацетилимидазол.

О О о о . о

II I! II Н/°в II /^N

СН3—С-О— С—СН3 СН3— С—О—PC СН3—С—N |

он ^ уксусный сжгиорио оцетилфосфйтп" ацетилимиоазол

АТР (форма храпения биологической энергии) также песет ангидридную структуру в трнфосфатпон боковой цепи.

АТР способен переносить энергию для активации карбоксильной группы, что показано с помощью простого биохимического эксперимента. Инкубация гомо-гената ткани печени (содержит свободные ферменты клеток печени) с глицниом, бензойном кислотой и АТР приводит к образованию N-беизонлглицина (гнппу-ровой кислоты). В действительности такая реакция представляет собой у млекопитающих механизм детоксикации, т. е. превращение ядовитого вещества (бен-ошюй кислоты) в безвредное путем присоединения к соединению, присутствующему в клетках (глицину), и затем выведения его с мочой. Первая стадия_

рто нуклеофильная атака бензоата по АТР с образованием активированного,

56

Глава 2

бснзоата (карбоксилата) и неорганического пирофосфата. Аминогруппа глицина затем -атакует этот промежуточный ангидрид с образованием N-бензоилирован-ного продукта.

Ad- айенин АМР-айеноэин-монофосфагп,

гиппуровая кислота

2.5. Биосинтез белков

Тот же самый принцип активации карбоксильной группы используется и в синтезе белков in vivo. Карбоксильная группа аминокислоты активируется, реагируя с АТР с промежуточным образованием ангидрида. Однако следующая стадия не сводится просто к атаке такого ангидрида второй аминокислотой, поскольку синтез белков включает строго определенное последовательное присоединение многих (до нескольких сотен) аминокислот. Матрица, или «организующая поверхность», должна участвовать в этом процессе для того, чтобы обеспечить правильную последовательность белковой молекулы. Макромолекулой, выполняющей функцию такой матрицы, является полинуклеотидтранс-портная рибонуклеиновая кислота (тРНК); строение полинуклео-тидов описано в следующей главе.

Биоорганическая химия аминокислот

57

Активация аминокислоты с помощью АТР — это промежуточная стадия, катализируемая ферментом амииоацил-тРНК-синте-тазой. 3'- или 2'-гидроксил концевой адениловой кислоты молекулы тРНК атакует промежуточный ангидрид с образованием молекулы аминоацил-тРНК-/СОО9

R—СН + АТР +тРНК(3' ОН)

XNH3®

аминокислота

Mi"

оминооцил- тРнк-cuHmemosa

точный о

тРНК

ОН

НО ОН

о

ф ;сн~с—о-трнк

H3N

ОМиНОйЦЪЛ-тРНК

Сложноэфирная связь с гидрокснлом тРНК представляет собой высокоэпергетнческую связь (благодаря соседнему 2'-гидро-ксилу и положительно заряженной аминогруппе), так что изменение свободной энергии суммарной реакции, катализируемой ферментом, близко к нулю. Каждая аминокислота имеет свою специфическую тРНК и один специфический фермент аминоацил-тРНК-синтетазу. В свою очередь каждая аминоацил-тРНК-син-тетаза использует в качестве субстрата только свою специфическую аминокислоту. Удалось до некоторой степени модифицировать природные аминокислоты, причем они продолжали служить субстратами фермента. Например, n-фторфенилаланин способен в определенной степени замещать фенилаланин.

После того как синтез аминоацил-тРНК завершен, аминокислота больше не участвует в узнавании. Специфичность определяется полинуклеотидной частью молекулы тРНК путем взаимодействия с генетической матрицей (мРНК), а также с другой поверхностью, на которой происходит белковый синтез,— клеточ-шой органеллой, называемой рибосомой.

Чтобы показать это, специфическую аминоацил-тРНК, несущую остаток цистеина (цистеинил-тРНКСу!! — цистеин присоединен

58

Глава 2

к своей специфической тРНК), модифицировали, каталитически восстанавливая боковую цепь аминокислоты до аланпиа. Инку* О О

тРНКС^-0— С\Лн, -^tPHK^O-Cv. JjH3 никель

Ренея .| CH2SH СН—Н

Цистпеинил- tPHK.c"s аланил-т РНКСУ*

бация in vivo такой модифицированной ампноацил-тРНК приводила к включению аланина в те положения белка, которые нормально содержали цистеин.

Синтез белка начинается и продолжается с N-конца. Известно, что в некоторых бактериях, дрожжах и высших организмах первая аминоацил-тРНК представляет собой N-формилметионин-тРНК'Ме*. Формилирование аминогруппы можно рассматривать как введение защитной группы, чтобы предотвратить ее участие в образовании пептидной связи. Таким образом, fMet-TPHKfMet первой связывается с рибосомой и мРНК- После того как синтез белка закончен, формильная группа удаляется ферментагивно (формилазой).

Рибосома — это крупная клеточная органелла, в состав которой входят РНК и несколько различных белков; она построена из двух субъединиц. Рибосома обеспечивает в высшей степени упорядоченную поверхность для синтеза белков, поскольку способна взаимодействовать с протяженными участками тРНК различных аминоацил-тРНК. Некоторые из рибосомных белков, вероятно, обладают каталитической активностью, тогда как остальные, как и рибосомные РНК (рРНК), принимают участие в специфических конформационных взаимодействиях, происходящих при белковом синтезе. Синтез белка — динамический процесс, однако он происходит упорядочение, путем последовательного присоединения аминокислот. Место присоединения fMet-TPHKfMet на рибосоме называется пептидилсвязывающим центром. Теперь мы подошли к непосредственному синтезу пептидной связи.

Вторая аминокислота (аминоацил-тРНК) также связывается с рибосомой (в так называемом аминоацил-тРИК-связывающем центре) в непосредственной близости от fMet-TPHKfMet. Хотя никакой химической реакции еще не произошло, уже для связывания требуется затратить работу: энергия поставляется молекулой GTP (гуанозинтрифосфат; сходен с АТР, но вместо аденииа содержит гуанин). Аминогруппа аминоацил-тРНК атакует затем f-метионин, при этом тРНКШе' становится уходящей группой и образуется пептидная связь. Эта реакция катализируется ферментом, но для образования пептидной связи не требуется ни АТР, ни GTP, поскольку энергия поставляется при расщеплении высо-коэпергетнческого эфира тРНК'Ме'. Образование пептидной связи завершено, однако, видимо, должны произойти еще некоторые

Биоорганическая химия аминокислот

5Й

Поверхность рибосомы

Рцентр А-центр .

JMet-TPHK*''/

З'-мРНК

RiPHK"

О ^

.О

о-с^

I

/СНч

S I

сн3

|пептьЭилгпрансферазо Р-центр А-центр .

vPHKfMet

З'-мРНК

RlPHKR

ОН

о

н^ж.

I

СН—R

гн ^ ^СН—С—NH

S новая

гептцЗная связь

Рис. 2.1. Образование пептидной связи в биологической системе. Весь процесс происходит на рибосоме, в двух связывающих центрах: Р (пептидил) и А (амн-ноацил). Реакция катализируется пептидилтрансферазным центром. Именно информация, переносимая мРНК (которая в свою очередь определяется генетическим материалом ДНК), определяет, какая из аминоацил-тРНК будет присоединяться в Р- и А-центрах.

физические изменения для того, чтобы следующая аминоацил--тРНК могла присоединиться к дипептпду. Дипептиднл-тРНК, находящаяся в амнноацил-тРНК-связывающем центре, физически перемещается в пептиднлсвязывающий центр, одновременно вытесняя тРНК,Ме1. Очень вероятно, что этот процесс происходит вследствие конформационных изменений