Биологический каталог




Ферменты. Том 1

Автор М.Диксон, Э.Уэбб

апример, полосы поглощения при 340 нм в восстановленном, но не в окисленном состоянии, и это дает возможность использовать спект-рофотометрический метод при изучении действия большого числа дегидрогеназ. Можно привести ряд примеров подобного рода. 'Флавопротеидные ферменты поглощают при 450 нм в окисленной форме весьма интенсивно, а в восстановленной гораздо слабее. Цитохромы в восстановленной форме дают очень четкие Полосы поглощения в видимой области спектра, и потому спектрофотометрический метод является идеальным для изучения процессов их окисления и восстановления. Наконец, с помощью спектрофотометрических методов можно очень точно проследить за ферментативным восстановлением феррицианида или красителей типа метиленового синего и индофенолового синего.

В табл. 2 1 приведены молярные коэффициенты поглощения ряда окислителей и восстановителей, которые обычно используются в подобных реакциях.

Таким образом, с помощью спектрофотометра легко изучать действие практически всех окислительных ферментов. К сожалению, такие ферментативные реакции, как перенос фосфатных или гликозильных групп, обычно не сопровождаются изменением поглощения, и эти реакции приходится изучать с помощью Других методов. 38

Глава 2

Таблица 2.1

Молярные коэффициенты поглощения ряда окислителей и восстановителей

Длина волны, нм Молярные коэффициенты поглощения Вещество восстановленная форма окисленная форма

FMN 450 — 12 200

FAD 450 — 11 300

NAD, NADP 340 6 220 0

Дихлорфенолиндофенол 600 0 21 000

Метиленовый синий (в изобестиче-ской точке) 610 0 41 000

Феназинметасульфат 388 1 500 22 000

Бензо(гидро)хинон 295 2 640 322

Аскорбат 265 15 100 -

Дитионит 314 8 000 0

Ферри (ферро) цианид 420 0 1 020

Ферри(ферро) цианид 314 340 1 140

Цитохром с 550 29 500 8 300

Молярный коэффициент поглощения — это поглощение 1 М раствора вещества в односаитиметровой кювете; молярную концентрацию раствора находят путем деления наблюдаемой величины поглощения на величину молярного коэффициента поглощения. Ссылки на источники приведены в [1112] Указанные длины волн соответствуют максимумам полос поглощения, за исключением величин для метиленового синего, восстановленного феназинметасульфата, ферри- и ферроцианида при 314 нм и окисленного цитохрома с. Следует отметить, что некоторые из приведенных веществ, особенно восстановленные формы флавинов и красителей, быстро реагируют с кислородом, от которого система должна быть полностью изолирована. Приспособления для анаэробной спектрофотометрии рассматриваются в работе Диксона [1111].

Иногда в те* случаях, когда не происходит изменений поглощения при превращении обычных субстратов, оказывается возможным использовать специальный субстрат, превращение которого сопровождается изменением поглощения при подходящей длине волны. Для гидролитических ферментов в качестве таких субстратов широко используют производные нитрофенола; например, при гидролизе n-нитрофенилсульфата максимум поглощения смещается от 278 к 318 нм, и ход реакции, катализируемой арилсульфатазой (КФ 3.1.6.1), может быть прослежен по значительному увеличению поглощения при 330 нм [5012]. Сходным образом реакция образования тиоэфирной связи бу-

Методика работы с ферментами

39'

тирил-СоА-синтетазой (КФ 6.2.1.2) может быть прослежена при использовании кислоты с системой сопряженных двойных связей (например, сорбиновой кислоты, так как при образовании эфира этой кислоты возникает новая полоса поглощения в области 300 нм [4944]).

Даже если течение изучаемой ферментативной реакции не сопровождается заметным изменением поглощения, то все же спектрофотометрический метод можно нередко использовать, прибегая к добавлению к изучаемой системе другого фермента, действие которого на продукты реакции приводит к изменению спектра поглощения. Во многих случаях, например, продукт ферментативной реакции сам служит субстратом для одной из дегидрогеназ, поэтому добавление избытка (очищенной) дегид-рогеназы вместе с соответствующим коферментом позволяет проследить за ходом первой реакции по восстановлению кофер-мента, которое определяется по увеличению поглощения при 340 нм. За образованием цитрата из аконитата под действием аконитат-гидратазы (КФ 4.2.1.3) можно проследить после добавления изоцитратдегидрогеназы (КФ 1.1.1.42) иNADP [3498]. Важно отметить, что необходимо добавлять избыток дегидро-геназы (или же уменьшать в достаточной мере количество изучаемого фермента) с таким расчетом, чтобы скорость всего процесса никоим образом не лимитировалась дегидрогеназной реакцией и восстановление кофермента точно следовало за первичной ферментативной реакцией. Примером подобного рода может служить также превращение NADP в NAD под действием очищенной фосфатазы (КФ 3.1.3.1) [3269], которое можно проследить в присутствии дрожжевой алкогольдегидрогеназы (КФ 1.1.1.1) и спирта. Эта дегидрогеназа не реагирует с NADP. но. как только образуется NAD, он сразу же ею восстанавливается.

Можно назвать и еще один вариант, а именно тот, при котором продукт первичной реакции является одновременно окисленным продуктом дегидрогеназной системы. В этом случае в реакционную смесь часто добавляют дегидрогеназу и восстановленную форму кофермента и затем следят за реакцией: уменьшение поглощения характеризует при этом окисление кофермента в обратной дегидрогеназной реакции. Метод Рэкера [3787] для измерения активности 6-фосфофруктокиназы (КФ 2.7.1.11) может служить примером такого рода. Этот фермент фосфорилирует фруктозо-6-фосфат с образованием фруктозо-1,6-бисфосфата. При добавлении вместе с восстановленным коферментом избытка фруктозобисфосфат-альдолазы (КФ 4.1.2.13) (которая превращает фруктозо-1,6-бисфосфат в смесь глице-ральдегид-3-фосфата и дигидроксиацетонфосфата) и глицерол-3-фосфат — дегидрогеназы (КФ 1.1.1.8) (которая катализирует восстановление дигидроксиацетонфосфата с помощью NADH)

-40

Глава 2

^фосфокиназная реакция может быть прослежена по окислению йофермента. Таких систем можно подобрать достаточно много, и метод не ограничивается использованием только дегидрогеназ.

Б. ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ МЕТОДЫ

В ряде случаев флуоресцентный метод является более чувствительным, чем спектрофотометрический. Флавиновые соединения, сильно флуоресцирующие в окисленной форме, утрачивают флуоресценцию при восстановлении. NAD и NADP не флуоресцируют в окисленной форме, но в восстановленной форме обладают голубой флуоресценцией; это свойство используется как основа чувствительного метода определения для регистрации протекания ферментативных окислительных и восстановительных реакций [959, 4711].

Помимо определения скоростей реакций, о котором здесь в основном идет речь, измерения флуоресценции позволяют получить значительную дополнительную информацию. Например, при взаимодействии флуоресцентной молекулы с другими участвующими в реакции веществами или с ферментным белком нередко изменяется интенсивность флуоресценции, благодаря чему можно рассчитать константы сродства; поведение же флуоресцентных групп в молекулах белка позволяет судить об их ближайшем окружении [528].

В. МАНОМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Манометрические методы представляют собой удобные и точные методы для наблюдения за ходом реакций, в которых один из компонентов находится в газообразном состоянии. Они, следовательно, пригодны для изучения оксидаз (поглощение 02) или декарбоксилаз (выделение СОг), а также таких ферментов, как гидрогеназа, уреаза или карбоангидраза. Однако их использование отнюдь не ограничивается реакциями подобного рода. Многочисленные реакции, при которых образуется или потребляется щелочь или кислота, могут быть изучены с помощью манометрических методов, если эти реакции проводить в бикарбонатном буфере, находящемся в равновесии с газовой смесью, содержащей определенный процент С02. Образующаяся кислота будет освобождать из бикарбонатного буфера соответствующее количество С02, которое можно измерить манометрически.

Примером такого рода может служить окисление альдегидной группы до карбоксильной, скажем, при действии глицераль-дегидфосфатдегидрогеназы (КФ 1.2.1.12) в системе гликолиза. Границы применения манометрического метода можно расширить, дополняя, например, действие изучаемых дегидрогеназ

Методика работы с ферментами действием глицеральдегидфосфатдегидрогеназы, и многие де-гидрогеназные реакции, осуществление которых связано с участием кофермента, изучались именно манометрически [1646]. Карбоксильные группы могут образовываться и в результате гидролиза пептидной или эфирной связи, что было использовано при манометрическом изучении гидролиза белков [2592], а также при изучении действия эстераз, особенно действия холин-эстеразы (КФ 3.1.1.8) [104]. Были изучены также некоторые реакции переноса фосфата, связанные с изменением ионизации фосфатного остатка [845]. Феррицианид восстанавливается многими окислительными ферментами, и его восстановлени

страница 9
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Ферменты. Том 1" (3.77Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(20.11.2018)