Биологический каталог




Ферменты. Том 1

Автор М.Диксон, Э.Уэбб

лабильную связь; в результате образуется либо 5'-монофосфат, либо З'-моно-фосфат.

4. Присутствие определенного основания в нуклеотидной единице, примыкающей к атакуемой связи. Специфичность некоторых ферментов в этом отношении весьма невелика: рибонуклеазы из растений и Е. coli (КФ 3.1.27.1) гидролизуют связи по З'-положению как пуриновых, так и пиримидиновых нуклеотидов. Панкреатическая рибонук-леаза (КФ 3.1.27.5) занимает промежуточное положение,

Специфичность действия ферментов она атакует связи по З'-положению любого пиримидино-вого нуклеотида. В то же время фермент КФ 3.1.27.3 является строго специфичной эндонуклеазой, расщепляющей РНК по З'-положению гуанилатного остатка.

5. Наличие определенной вторичной структуры: либо одно-цепочечной, либо двухцепочечной нуклеиновой кислоты. Большинство нуклеаз проявляют очень высокую степень специфичности по рассматриваемому признаку; отношение скоростей гидролиза нуклеиновых кислот с различной вторичной структурой может превышать 10 ООО.

6. Нуклеазы, атакующие двухцепочечную нуклеиновую кислоту, могут гидролизовать обе цепи либо в одном участке, так что продукты разделяются, либо в разных участках; в последнем случае для разделения продуктов необходим гидролиз ряда связей [5260].

7. Некоторые дезоксирибонуклеазы не способны атаковать ДНК «своего» вида, их называют ферментами рестрикции [710].

8. Наличие определенного участка молекулы нуклеиновой кислоты. Джонсон и Ласковски [2247] показали, что нук-леазу из бобов фасоли (КФ 3.1.30.2) можно считать «специфичной к определенным участкам». Фермент проявляет высокую специфичность к одноцепочечной (но не к нативной) ДНК; он атакует также РНК и арабинозилоли-гонуклеотиды, образуя во всех случаях 5'-фосфоолигонук-леотиды. Если субстратом является ДНК Х-фага, то ее молекула расщепляется на две половины, очевидно, в результате гидролиза ее в центральной части, в которой весьма высока концентрация А—Т-пар. Следовательно, фермент специфичен к «рыхлым» участкам нативного субстрата.

Некоторые из этих соображений были учтены в новой классификации нуклеаз [1266а], которая используется в данной книге. Введено четырнадцать новых подгрупп (3.1.11, 13—16, 21—27, 30—31) с учетом того, являются ли ферменты эндо-или экзонуклеазами, специфичны ли они к рибонуклеиновым или дезоксирибонуклеиновым кислотам или действуют на оба вида, образуют ли они 5'-фосфомоноэфиры или другие фрагменты, являются ли они специфичными к определенным соседним основаниям или последовательностям. Известны еще не все возможные комбинации этих факторов специфичности; при дальнейшем изучении нуклеаз может оказаться необходимым введение дополнительных подгрупп.

ГЛИКОЗИДАЗЫ

Ферменты этой большой и важной группы расщепляют в основном субстраты, в молекуле которых не содержится заряженГлава 6

ных групп. В этих субстратах доминирующую роль играет расположение гидроксильных групп и атомов водорода, и специфичность гликозидаз определяется конфигурацией каждой —СНОН-группы. Как правило, гликозидазы проявляют высокую степень специфичности по отношению к определенному мо-носахаридному кольцу; однако присоединенная агликоновая группа также может оказывать более или менее заметное влияние. В некоторых случаях (например, у нуклеозидаз) это влияние агликона бывает выражено даже сильнее, чем влияние мо-носахаридного компонента. Инозиназа (КФ 3.2.2.2), например, гидролизует гипоксантинрибозид, но не действует на ксантин-рибозид.

В литературе имеется значительная информация о менее специфичных гликозидазах, например о ферментах КФ 3.2.1.20—26; большой материал приведен в обзорах Гельфериха [1893], Пигмана [3686] и Готшалка [1626]. Поскольку большинство прежних исследований было проведено с неочищенными препаратами ферментов, некоторые виды минорной активности могли быть обусловлены примесными ферментами. Однако ясно, что эта группа ферментов высокоспецифична в отношении конфигурации кольца сахара: например p-D-глюкозидаза (КФ 3.2.1.21) не действует на p-D-маннозиды, p-D-галактозиды или a-D-глюкозиды. Замещение по С-2, С-3 или С-4 полностью предотвращает гидролиз р-глюкозидазой; замещение по С-6 снижает скорость гидролиза, а замещение группы —СНгОН на Н уменьшает скорость гидролиза в 200 раз. В ряде случаев отмечено влияние природы агликона, связанное, по-видимому, не с размерами или формой этого фрагмента молекулы, а с электроноаицепторными свойствами группы [3378].

Весьма характерны особенности специфичности ферментов, гидролизующих полисахариды, например амилаз (КФ 3.2.1.1— 3). Все эти три фермента атакуют в цепях крахмала или гликогена а-1,4-связи, однако положение атакуемых связей в по-лисахаридной цепи различно. р-Амилаза отщепляет мальтоз-ные фрагменты от нередуцирующих концов молекулы, вызывая инверсию по месту расщепляемой связи; экзо-1,4-а-глюкозида-за отщепляет от тех же концов одиночные остатки сахара; под действием a-амилазы образуется смесь декстринов, по-видимому, в результате неупорядоченной атаки цепей.

В исследованиях, проведенных в последнее время на небольших субстратах, меченных 14С, показано, что a-амилаза проявляет заметную специфичность по отношению к гидролизуемым связям [3958]. При гидролизе a-амилазой мальтотриозы обнаруживаются только глюкоза и мальтоза; если меченым является восстанавливающий конец, то находят как меченую глюкозу, так и меченую мальтозу. При низкой концентрации субстрата скорость образования меченой глюкозы в 4 раза боль-

Специфичность действия ферментов

369)

ше скорости образования меченой мальтозы, однако при повышении концентрации субстрата отношение скоростей сначала выравнивается, а затем становится противоположным исходному. При высокой концентрации две молекулы мальтотриозы конденсируются, образуя мальтогексозу; при гидролизе последней образуются меченая мальтоза и немеченые глюкоза и маль-тотриоза. При интерпретации этих результатов предполагают, что активный центр а-амилазы имеет пять подцентров, взаимодействующих с остатками глюкозы; каталитический центр локализован между подцентрами 2 и 3 ([3958], см. также обсуждение в [4721]). В случае пентасахаридного субстрата образуется только один фермент-субстратный комплекс, и первичная атака осуществляется исключительно по связи между вторым и третьим остатками сахара; при этом образуется меченая мальтоза и немеченая мальтотриоза. С другими субстратами может образовываться ряд комплексов; при этом гидроли-зуются несколько связей, однако с различными скоростями, как показано на рис. 6.7.

В экспериментах описанного типа определяют начальные скорости образования меченых продуктов. На основании ряда исследований с различными амилазами высказано предположение о возможности множественной атаки субстрата, когда в течение жизни одного фермент-субстратного комплекса гидро-лизуются несколько связей; при этом имеется высокая вероятность гидролиза связи, находящейся поблизости от только что

G-G

0,16 0,84 i 1 g——g—-с

0,7 0,3

с,-с,-—с,——G "

G

0,01 0,05 0,28 0,4 0,4 G-g—-— g—-—g —-—g—-g—-о-о*

Рис. 6.7. Частота первоначальной атаки различных гликозидных связей в оли-госахаридах (меченных 14С) а-амилазой [3958]. G —остаток глюкозы, связанный а-1,4-связью; G* — 14С-глюкоза, меченная на редуцирующем конце. Вертикальные стрелки указывают на гидролизуемые связи; цифры соответствуют относительной частоте первоначальной атаки.

-gJ-g-

0,01 0,42 0,67 I , I , I

G-

0,01 0, is 0,28 0,i7 g--g—-—g—-—g—-—g-gГлава 6

прогидролизованной. В предельном случае («атака одиночной цепи») фермент полностью гидролизует одну молекулу субстрата, прежде чем начинает гидролизовать другую. Выраженность феномена множественной атаки, по-видимому, изменяется в зависимости от экспериментальных условий; так, в случае действия панкреатической а-амилазы при рН 10,5 после образования фермент-субстратного комплекса гидролизуется одна связь, в то время как при рН 6,9 наблюдается выраженная множественная атака, перемещающаяся от первоначально атакуемой связи в направлении нередуцирующего конца [3959]. Экспериментальные данные, подтверждающие протекание множественной атаки, и кинетический анализ процесса весьма подробно рассмотрены в [4721].

ПЕПТИДАЗЫ

Одно время считали, что специфичность протеолитических ферментов определяется величиной молекулы субстрата, и на этом основании подразделяли эти ферменты на протеииазы и пептидазы. Однако, как только исследователям стало доступно большое число синтетических пептидов, обнаружилось, что такое разделение ошибочно, ибо протеииазы в действительности способны гидролизовать также и очень небольшие пептиды, если только эти пептиды имеют соответствующую структуру. Установив этот факт, Бергман радикально изменил представления, царившие в этой области энзимологии. Теперь нам ясно, что определяющим фактором служит не величина молекулы субстрата, а природа аминокислотных боковых групп, находящихся по соседству с гидролизуемой связью. Установлено, что каждый фермент предъявляет совер

страница 83
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Ферменты. Том 1" (3.77Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(24.09.2018)