Биологический каталог




Ферменты. Том 1

Автор М.Диксон, Э.Уэбб

олучила широкого применения в энзимологической литературе. Как правило, за единицу активности принимается количество фермента, превращающего 1 мкмоль субстрата в 1 мин, реже — в 1 с или в 1 ч. — Прим. ред. Глава 2

ну минуту одной молекулой фермента. Если фермент имеет простетическую группу или каталитический центр, концентрация которых доступна измерению, то его каталитическую силу можно выразить в величинах активности каталитического центра, иначе говоря, числом молекул субстрата, превращаемых в одну минуту одним каталитическим центром».

«Рекомендуется определять активность ферментов по возможности иа основе измерений начальной скорости ферментативной реакции во избежание осложнений, зависящих, например, от обратимости реакции или от образования тормозящих реакцию продуктов. Концентрация субстрата должна, если это достижимо, быть достаточной для насыщения фермента, с тем чтобы в стандартном тесте кинетика реакции приближалась к кинетике нулевого порядка. Там, где приходится применять субоптимальную концентрацию субстрата, рекомендуется определять константу Михаэлиса, что позволяет по измеренным скоростям реакции вычислить скорость реакции в системе, насыщенной субстратом».

«Если реагируют две идентичные молекулы, то единицей является количество фермента, которое катализирует превращение двух микромолей субстрата в минуту».

Следует отметить, что единицы, определение которых приведено выше, в отличие от многих ранее предлагавшихся единиц, являются абсолютными, что дает возможность сравнивать активность различных ферментов. Этими единицами можно пользоваться во всех тех случаях, когда хорошо известен характер катализируемой реакции.

Для определения удельной активности фермента необходимо измерить скорость реакции и установить то количество фермента, которое обеспечивает наблюдаемую скорость. Вторая задача не представляет трудностей, если фермент доступен в чистом виде, что позволяет получить его раствор заданной концентрации, или если количество фермента можно определить спектро-фотометрически или же химически. В том случае, когда это невозможно, удельную активность фермента, очевидно, нельзя определить, хотя можно определить удельную активность препарата (отличающуюся от активности чистого фермента). Если известна удельная активность чистого фермента, то определение удельной активности препарата, т. е. активности на единицу веса препарата, позволяет охарактеризовать чистоту препарата.

СРОДСТВО ФЕРМЕНТА К РЕАГИРУЮЩИМ ВЕЩЕСТВАМ

Катализируемые ферментами реакции осуществляются в комплексах фермента с реагирующими веществами. Концентрации таких комплексов в данный момент определяются концентрациями фермента и реагирующих веществ, а также величина-

Методика работы с ферментами ми, характеризующими сродство фермента к реагирующим веществам. Поэтому определение сродства фермента к реагирующим веществам имеет чрезвычайно важное значение при изучении ферментативных реакций.

Равновесие между комплексом и его компонентами, находящимися в свободном состоянии, может быть выражено либо при помощи константы ассоциации, либо при помощи константы диссоциации. Однако уже давно при изучении кинетики действия ферментов пользуются, как правило, только константой диссоциации. Мы будем следовать этой практике, которая одобрена Международным биохимическим союзом.

Фермент может соединяться с веществами двух классов, а именно с теми, которые изменяются в процессе реакции (т. е. с субстратами), и с теми, которые в результате реакции не изменяются. Среди последних некоторые могут быть ингибиторами, а некоторые — активаторами. Особо важное значение, очевидно, имеет константа сродства фермент—субстрат.

Вопрос о зависимости скорости реакции от концентрации субстрата составляет важный раздел кинетики ферментов, и он подробно рассматривается в гл. 4. В подавляющем большинстве случаев эта зависимость выражается соотношением

(2.1)

где v — скорость реакции при концентрации субстрата, равной s; V—максимальная скорость, достигаемая при концентрации субстрата, достаточно высокой для насыщения фермента; Км— константа Михаэлиса рассматриваемого фермента для данного субстрата. Эту константу можно определить несколькими графическими методами, которые описаны в гл. 4. Км численно равна концентрации субстрата, при которой скорость реакции вдвое меньше максимальной. Долгое время считали, что эта константа равна константе диссоциации фермент-субстратного комплекса, однако в настоящее время известно, что это не всегда так. Поэтому необходимо различать эти две величины; по рекомендации международной комиссии наименование «константа Михаэлиса» и символ Км следует сохранять для обозначения концентрации субстрата, при которой v=V/2, а наименование «субстратная константа» и символ Ks — для обозначения константы равновесия (диссоциации) реакции E + S = ES. Методы для определения истинной Ks описаны в гл. 4.

Ингибиторная константа Ki и активаторная константа Ка По аналогии с субстратной константой являются константами равновесия (диссоциации) реакций Е + 1 = Е1 и Е+А = ЕА соответственно, где I и А. — ингибитор и активатор. Методы определения Ki и Ка обсуждаются в гл. 8 и 9.

3» Глава 2

МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ИЗУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ

А. СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Многие субстраты и продукты ферментативных реакций поглощают свет либо в видимой, либо в ультрафиолетовой области спектра. Наличие в молекуле двойной связи или кольцевой структуры обычно сказывается на характере спектра поглощения. Так как маловероятно, чтобы субстрат и продукт рассматриваемой ферментативной реакции обладали идентичными спектрами поглощения, часто оказывается возможным найти такую длину волны, при которой в результате рассматриваемого превращения поглощение значительно изменяется. Измеряя величину этого изменения, можно изучать течение данной ферментативной реакции на количественном уровне. Появление спектрофотометра Бекмана и других подобных приборов обеспечило лаборатории наиболее удобным методом для изучения ферментативных реакций, который теперь широко применяется. В тех случаях, когда можно применить спектрофотометрический метод, его обычно предпочитают любому другому вследствие его простоты и чувствительности. При этом нет необходимости отбирать пробы, не требуется каких-либо реагентов, помимо тех, которые находятся в реакционной смеси, и весь ход реакции может быть прослежен на одной небольшой пробе

Часто, когда необходимы только сравнительные определения, для измерения скорости реакции используют величины изменений оптической плотности и единицы фермента выражают в величинах изменения оптической плотности за определенное время. Если же необходимы данные, выраженные в абсолютных единицах, то предварительно измеряют поглощение субстрата и продукта реакции при избранной длине волны, так как существование линейной зависимости между оптической плотностью и концентрацией вещества позволяет быстро выразить результаты отсчетов в форме количества прореагировавшего субстрата.

При изучении ферментативных реакций с помощью этого метода необходимо, чтобы во время измерений кювета, содержащая реакционную смесь, находилась в условиях постоянной температуры. Обычные приборы не снабжены соответствующим приспособлением, и требуется специальный держатель кюветы с кожухом, по которому циркулирует вода из прибора типа ультратермостата.

В настоящее время имеется ряд приборов, которые позволяют непрерывно регистрировать изменения оптической плотности во времени при определенной длине волны. При этом результаты записываются в виде непрерывной кривой, а не в виде от-

Методика работы с ферментами ' дельных точек; это позволяет быстро и точно определять начальную скорость реакции. Непрерывная запись становится в

/ настоящее время одним из наиболее распространенных приемов наблюдения за скоростью ферментативных реакций.

Можно указать на отдельные типичные ферментные системы, которые изучались с помощью спектрофотометрических методов

I (вообще говоря, число случаев, в которых эти методы применя-

* лись, очень велико). Во-первых, имеются реакции, в которых

* продукт поглощает свет при данной длине волны, а субстрат не / поглощает. Сюда относятся, в частности, обратимые реакции уприсоединения групп по месту двойных связей, катализируе-' мые, например, енолазой (КФ 4.2 1.11) [4989] и фумарат-гидра-

тазой (КФ 4 2.1.2) [3009,3788]. В случае фумаратгидратазы

* фумарат благодаря наличию двойной связи довольно сильно поглощает при 300 нм, тогда как малат не поглощает при втой длине волны. При действии ксантиноксидазы (КФ 1.2.3.2) происходит изменение в кольцевой структуре субстрата; окисление гипоксантина до мочевой кислоты сопровождается значительным

увеличением поглощения при 290 нм [2301]. ! Имеется также большая группа окислительных ферментов; В катализируемых ими реакциях у второго реагента (акцептора Водорода) при восстановлении субстратом изменяется спектр поглощения. Коферменты NAD и NADP имеют, н

страница 8
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Ферменты. Том 1" (3.77Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Химический каталог

Copyright © 2009
(11.08.2020)