Биологический каталог




Ферменты. Том 1

Автор М.Диксон, Э.Уэбб

какой-либо ферментный препарат катализирует две различные реакции (или большее их число) и если нет полной уверенности в чистоте и гомогенности препарата, то прежде всего необходимо убедиться в том, что обе обнаруженные активности действительно принадлежат одному и тому же ферменту. Для доказательства того, что реакции осуществляются одним ферментом, был предложен ряд критериев, возможно не абсолютных каждый в отдельности, но очень надежных, если рассматривать их в совокупности. Перечень этих критериев можно найти у Холдейна [1749] и у М. Диксона [1106]. Ниже перечислены только наиболее убедительные критерии идентичности.

1. Невозможность разделить две активности методами фракционирования. Это, правда, может свидетельствовать и просто о том, что данные активности принадлежат ферментам, очень сходным по своим физическим свойствам. Однако если отрицательные результаты получаются при использовании целого ряда различных методов фракционирования, то такое доказательство идентичности становится весьма убедительным.

2. Постоянство отношения величин активности при инактивации ферментного препарата. При наличии в препарате двух ферментов подобное постоянство было бы возможно лишь в том случае, если бы под влиянием всех воздействий инактиви-ровались равные доли обоих ферментов. Инактивацию можно вызвать контролируемым нагреванием, изменением рН, добавлением необратимо действующих ингибиторов, облучением и некоторыми другими воздействиями. Практически невероятно, чтобы во всех этих случаях инактивация двух различных ферментов протекала совершенно одинаково.

3. Совпадение величин Кг. Если обе наблюдаемые активности принадлежат одному и тому же ферменту, то при использовании конкурентного ингибитора величины Ki для любых субстратов должны совпадать.

4. Доказательство с помощью метода смешанных субстратов. При одновременном добавлении двух субстратов для двух реакций общая скорость реакции должна быть меньше суммы скоростей реакции, измеренных для каждого субстрата отдельно (если используются концентрации субстратов, достаточные или почти достаточные для насыщения фермента). При этом, однако, следует сделать следующую оговорку. Суммирование скоростей действительно служит хорошим доказательством того, что две реакции катализируются двумя различными ферментами, но если общая скорость реакции меньше суммы скоростей отдельных реакций, то это еще не может служить окон-

Специфичность действия ферментов чательным доказательством наличия только одного фермента, так как действие каждого из ферментов может конкурентно тормозиться субстратом другого фермента. Результаты количественных измерений для двух реакций, одновременно катализируемых одним и тем же ферментом, обсуждаются на с. 114.

Помимо этих четырех критериев был предложен и ряд других, использовавшихся в отдельных работах. Однако все они менее надежны. Так, например, кривые рН — активность для двух субстратов, на которые действует один и тот же фермент, не обязательно должны совпадать, особенно в том случае, если хотя бы один из субстратов претерпевает ионизацию. Далее, как правило, торможение двух реакций при данной концентрации конкурентного ингибитора не бывает одинаковым, так как торможение зависит от сродства каждого из субстратов к данному ферменту. Кофакторы также не обязательно должны влиять на обе реакции одинаково.

ОБЩИЕ ЗАМЕЧАНИЯ О СПЕЦИФИЧНОСТИ

Различные группы ферментов значительно отличаются друг от друга по степени своей специфичности. Среди ферментов,, перечисленных в Списке, очень многие обладают высокой специфичностью. Сюда относятся прежде всего дегидрогеназы, ки-назы и синтетазы. В большинстве случаев эти ферменты строго специфичны по отношению к обоим компонентам бимолекулярной реакции (или ко всем трем, если речь идет о тримолеку-лярных реакциях, катализируемых синтетазами) и лишь в немногих случаях — к одному из них. Так, алкогольдегидрогеназа (КФ 1.1.1.1) обладает, например, высокой специфичностью по отношению только к одному из субстратов, а именно к NAD, и незначительной специфичностью по отношению к другому субстрату — спирту. На противоположном конце шкалы находятся несколько гидролитических ферментов. Примерами могут служить эстеразы, действующие на обширный ряд эфиров карбоновых кислот, фосфатазы, действующие на эфиры фосфорной кислоты, и пептидазы, расщепляющие пептиды. Но и среди них имеются ферменты с высокой специфичностью, например фосфолипазы (из группы эстераз), а также некоторые фосфатазы и пептидазы.

В редких случаях обнаружена двойственная специфичность. Так ксантиноксидаза (КФ 1.2 3.2), весьма специфически настроенная на окисление пуринов, окисляет также альдегиды [1106], а альдегидоксидаза печени (КФ 12 3.1) окисляет также производные пиридина и хинолина. В приведенных примерах фермент катализирует реакции одного и того же типа с» двумя различными группами субстратов. В то же время изве-. стны и несколько случаев, когда фермент действует на один щ Глава 6

тот же субстрат двумя различными путями. В качестве примера можно привести дегидрогеназы, декарбоксилирующие малат и изоцитрат (КФ 1.1.1.38, 40 и 42), которые либо восстанавливают, либо декарбоксилируют соответствующие оксокислоты. Специфичность реакции зависит иногда от четвертичной структуры фермента; активность одной из субъединиц может изменяться в присутствии других субъединиц. Например, белок А, компонент лактозосинтазы (ЕФ 2.4.1.22), катализирует перенос галактозы от UDP-галактозы на N-ацетилглю-козамин; лактозу из UDP-галактозы и глюкозы образует только «полный» фермент, содержащий помимо белка А гх-лакталь-бумин.

СТЕРЕОСПЕЦИФИЧНОСТЬ ФЕРМЕНТА

Оптически активные субстраты

Помимо химической специфичности ферменты обнаруживают при действии на вещества, содержащие асимметрические центры, стерическую специфичность. Установлено, что при действии на субстраты, содержащие асимметрический атом углерода, ферменты обычно атакуют только один из двух оптических изомеров. Специфичность этого типа обычно абсолютна; в тех случаях, когда в ферментативную реакцию вовлекается сама асимметрическая группа, например при окислении СНОН-группы оксикислот, второй изомер вовсе не атакуется. Однако если асимметрическая группа находится в молекуле субстрата на некотором расстоянии от реагирующей группы, то нередко атакуются оба изомера; правда, при этом обычно наблюдаются более или менее выраженные различия в скорости превращения изомеров (примером может служить гидролиз оптически активных эфиров под действием карбоксилэстеразы 15010]).

Во всех тех случаях, когда в Списке ферментов указана принадлежность субстрата к D- или L-ряду, это следует понимать как указание на то, что данный фермент неспособен с измеримой скоростью атаковать второй изомер субстрата. Если в подобных случаях фермент действует на смесь D- и L-изомеров, то в реакцию вступает только половина субстрата (именно на этом явлении основывается один из способов разделения рацемических смесей).

В тех случаях, когда субстрат представлен симметрической молекулой, а продукт содержит асимметрический атом углерода, под действием фермента почти всегда образуется один оптический изомер; другими словами, происходит «асимметрический синтез». Например, при восстановлении пирувата лактат-

Специфичность действия ферментов дегидрогеназой (КФ 1.1.1.27) образуется только L-лактат, но та же реакция, катализируемая другой дегидрогеназой (КФ 1.1.1.28), дает только D-лактат; при восстановлении аммонийной соли 2-оксоглутарата L-глутаматдегидрогеназами (КФ 1.4.1.2—4) образуется только L-глутамат; фосфорилирование глицерина под действием глицеролкиназы (КФ 2.7.1.30) дает только хл-глицерол-З-фосфат. При синтезе L-треонина путем конденсации глицина с ацетальдегидом [побочная реакция фермента (КФ 2.1.2.1)] возникают одновременно два асимметрических атома углерода. В соединениях, имеющих несколько асимметрических центров, каждый центр может оказывать влияние на специфичность фермента [5117].

Когда стереохимическая специфичность абсолютна, неата-куемый изомер по большей части не тормозит превращения субстрата; однако иногда он выступает как конкурентный ингибитор и, следовательно, связывается с активным центром фермента. Используя это обстоятельство, можно определить степень сродства при данном взаимодействии. Подобные определения неожиданно показали, что в ряде случаев сродство к ферменту у изомера, выступающего в роли ингибитора, оказывается даже большим, чем у субстрата. Такого рода пример приведен в табл. 6.1, в которой сравнивается действие химотрипсина (КФ 3.4.21.1) на несколько пар стереоизомеров. Из этой таблицы видно, что для первых четырех пар соединений сродство фермента к форме, которая не реагирует, выше, чем

Таблица 6.1

Сродство некоторых пар стереоизомеров к химотрипсину [5010]

Соединение Км, мМ Кг мМ

Ацетил-Ь-триптофанамид Ацетил-Б-триптофанамид 5,3 2,7

Ацетил-Ь-тирозииамид Ацетил-О-тирозниамид 30,5 12,0

Никотин ил-Ь-триптофанамид Никотинил-Б-триптофанамид 2,7 1,4

страница 75
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Ферменты. Том 1" (3.77Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(11.12.2018)