Биологический каталог




Ферменты. Том 1

Автор М.Диксон, Э.Уэбб

стереохимическая специфичность; в случае обратимости реакции — специфичность в обратной реакции; специфичность по отношению к ингибиторам.

Характеристика активных центров: число активных центров в молекуле; их химическая структура; влияние, оказываемое на субстрат при его взаимодействии с активным центром; механизм реакции; характер действия простетической группы, если таковая имеется.

Кинетические характеристики: удельная активность; молекулярная активность; абсолютная активность в расчете на один активный центр; константы скоростей соединения фермента с субстратом, диссоциации субстрата из фермент-субстратного комплекса, диссоциации продукта и суммарной реакции; влияние активаторов; влияние различных ионов при различных рН; аллостерические эффекты, последовательность стадий реакции, уравнение скорости реакции и его интерпретация в терминах связывающих участков.

Термодинамические свойства: обратимость и константа равновесия ферментативной реакции; температурный коэффициент; тепловые эффекты; величины свободной энергии и энтропии соединения фермента с субстратом, активации комплекса фермент— субстрат, превращения его в комплекс фермент — продукт и диссоциации этого комплекса на свободный фермент и продукт; сопоставление этих величин с соответствующими величинами, характеризующими суммарную реакцию; сродство фермента к субстрату; константа Михаэлиса; влияние рН на срод-

Методика работы с ферментами ство фермента к субстрату (для получения сведений о природе связывающих субстрат групп); сродство фермента к ингибиторам, константы ингибиторов и влияние на них рН; конкуренция ингибиторов с субстратом.

Биологические свойства: значение фермента в реакциях обмена веществ; сопряжение с действием других ферментов при осуществлении биологических реакций; распространенность фермента у различных видов живых существ и его распределение в различных тканях; внутриклеточная локализация; образование фермента из предшественников; адаптивное образование; генетика фермента, влияние генных мутаций; существование изоферментов; влияние недостатка фермента на организм; биологические эффекты избирательного «отравления» фермента; иммунологическое поведение; антиферменты.

Большинство перечисленных свойств ферментов рассматриваются в последующих главах; однако нам кажется полезным привести в этой главе некоторые данные по вопросу о технике определения двух основных величин, характеризующих соответственно скорость ферментативной реакции и сродство фермента к субстрату.

УДЕЛЬНАЯ И МОЛЕКУЛЯРНАЯ АКТИВНОСТИ

Целесообразно дать определение величине, характеризующей скорость реакции, которая может быть достигнута при данном количестве препарата фермента. В прошлом для этого пользовались самыми различными показателями. В других областях науки активность, отнесенную к единице веса, принято называть удельной, а активность в расчете на молекулу — молекулярной. Этими же обозначениями можно воспользоваться и при характеристике ферментативной активности.

Удельную активность можно выразить различными способами: 1) в произвольно выбранных единицах на 1 мг фермента (единица активности характеризует при этом превращение определенного количества субстрата или образование определенного количества продукта за определенное время); 2) в единицах константы скорости реакции на 1 мг фермента; 3) числом микромолей субстрата, превращаемых за 1 мин на 1 мг фео-мента; 4) числом микромолей субстрата, превращаемых за 1 мин на 100 000 г фермента.

1) Определение удельной активности числом условных единиц на 1 мг фермента представляет собой наиболее простой метод, но получаемая этим способом информация является далеко не полной. Единицы активности обычно выбирают совершенно произвольно и для разных ферментов используют различные единицы, что весьма затрудняет сравнение данных для отдельных ферментов. Нередко для одного и того же фермента Глава 2

разные авторы используют различные единицы активности. В отдельных случаях для обозначения удельной активности ферментов использовали специальные показатели. Таков, например, показатель P.Z. (пурпурогаллиновое число) для пер-оксидаз.

2) Иногда для измерения удельной активности применяли константу скорости ферментативной реакции. Так, например, активность каталазы (КФ 1.11.1.6; «Kat. f.»; Katalasefahigkeit) выражали константой скорости реакции (мин-1), рассчитанной по стандартному уравнению мономолекулярной реакции (протекающей в определенных условиях) и деленной на число граммов (не миллиграммов!) фермента, находящихся во всем объеме опытной пробы, равном 51 мл. Так как в действительности реакция не следует кинетике мономолекулярной реакции, этот метод нельзя считать достаточно удовлетворительным. Недоразумения возникали также и вследствие того, что одни авторы при расчете константы скорости используют десятичные, а дру-тие — натуральные логарифмы. Для пептидаз широко использовался «протеолитический коэффициент» [2145]. При низких концентрациях субстрата реакция гидролиза идет по мономо-лекулярному типу, и в опыте с определенным субстратом протеолитический коэффициент представляет собой константу скорости мономолекулярной реакции (протекающей в определенных условиях), деленную на концентрацию фермента. Показатель «протеолигическое отношение» представляет собой отношение протеолитических коэффициентов, полученных в опытах с двумя разными субстратами. Этот показатель применяли для оценки гомогенности фермента.

3) Показатель «число микромолей субстрата, превращаемых за 1 мин на 1 мг фермента» принят в настоящее время по международному соглашению в качестве основы для определения удельной активности [3900].

4) Следует считать мало удачной попытку охарактеризовать молекулярную активность фермента (при неизвестной молекулярной массе), принимая его молекулярную массу в среднем равной 100 000. Если молекулярная масса фермента неизвестна, то лучше пользоваться удельной активностью, а если она известна, то следует вычислить значение молекулярной активности.

Молекулярную активность выражали: а) числом молекул субстрата, превращаемых за одну минуту на одну молекулу фермента, или б) числом молекул субстрата, превращаемых за одну минуту на один активный центр (это предполагает наличие метода, позволяющего определить число активных центров). Термин «число оборотов» в прошлом использовали для обозначения обеих этих величин. Так как это приводило к недоразумениям, то по международному соглашению рекомендуется при-

Методика работы с ферментами менять термин «молекулярная активность» в случае (а), в случае же (б) пользоваться термином «активность каталитического центра» [3900].

Все три величины, установленные Комиссией по ферментам Международного биохимического союза, основываются на идее стандартной единицы фермента. В отчете Комиссии [3900] говорится следующее:

«Одна единица (Е) любого фермента представляет то коли-> чество фермента, которое при заданных условиях катализирует I превращение одного микромоля субстрата в одну минуту или I одного микроэквивалента затронутой группы в тех случаях, ког-f да атакуется более одной группы в каждой молекуле субстрата. * Должна быть указана температура, при которой проводится реакция; рекомендуется, где это возможно, придерживаться температуры 25 °С. Температура 25 °С была рекомендована в связи с тем, что она является стандартной в физической химии. Однако в 1964 г. Международный биохимический союз во втором издании своих рекомендаций [1265] предложил проводить определения при температуре 30 °С в связи с заявлениями из ряда i стран, климатические условия которых затрудняют термостати-рование при 25 °С. В 1972 г. в пересмотренных рекомендациях [1266] Комиссии по биохимической номенклатуре предлагается \ выражать активность фермента в каталах (символ кат); 1 кат это количество фермента, которое превращает 1 моль субстрата за 1 с (эта величина в 6-Ю7 раз больше прежней единицы) в соответствии с системой единиц SI; температура, однако, не была указана1. В 1976 г. в издании «Инструкции для авторов» Биохимического общества [412] эта единица активности была I адаптирована в отношении скорости, однако снова без уточнения | температуры; цитируем: «Единица количества фермента должна ' быть указана в каждой статье как величина характеризуемая скоростью реакции (моль/с) в определенных условиях... Едини-, цу количества фермента можно охарактеризовать также и другой скоростью, например 1 мкмоль субстрата/мин». Прочие условия, в частности рН и концентрация субстратов, должны быть по возможности оптимальными. Во избежание несоразмерно малых или больших величин допускается применение таких терминов, как меллиединицы (ME), килоединицы (кЕ) и т. п.»

«Удельная активность выражается в единицах фермента на 1 мг белка».

«Молекулярная активность соответствует числу единиц в одном микромоле фермента (при оптимальной концентрации субстрата), т. е. числу молекул субстрата, превращаемых в од-

1 За истекшие годы «катал» как единица активности фермента не п

страница 7
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Ферменты. Том 1" (3.77Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(19.10.2018)