Биологический каталог




Ферменты. Том 1

Автор М.Диксон, Э.Уэбб

ниченным слева временем смешивания реагирующих веществ, а справа — временем, соответствующим достижению максимального значения х. Подобные расчеты для опыта, результаты которого представлены на рис. 4.74, приводят к знаГлава 4

чению Лм = 4,1 • 10-7. Эти выводы подтверждаются также совпадением экспериментальных кривых с кривыми, полученными расчетным путем из уравнений при следующих значениях констант: 6+1 = 0,9-107 л/(моль-с), ?_1 = 0, 6+2 = 4,5 с-1 (рис. 4.74). Совпадение значений Км, определенных различными способами, свидетельствует о правильности результатов.

Полученные данные ясно показывают, что в рассматриваемых условиях Кш для пероксидазы практически равно k+2/k+u так что эта константа характеризует динамическое состояние, а не термодинамическое равновесие. Ks вносит лишь малый вклад в Км- Однако k+2 зависит от концентрации донора и при уменьшении последней может стать равной или даже меньшей, чем k-\. Таким образом, для одного и того же фермента Км может принимать значения от Km = Ks до KM — k+zlk+y. Величина Ks представляет собой результат экстраполяции Км при k+2, стремящейся к нулю.

В случаях, подобных рассмотренному выше, когда можно изменять k+2 независимо от k+i и k-i, например путем изменения концентрации второго реагента, участвующего в реакции распада, можно определить Ks и три константы скорости. Слейтер и Боннер [4321] высказали предположение, что если построить график независимости Км от V, то он будет представлять собой прямую, отсекающую от оси ординат и оси абсцисс отрезки, равные Ks и —k^e соответственно (рис. 4.76). В этом легко убедиться следующим образом. Согласно уравнению (4.19), Ки = Ks-\-k+2elk+xe. Подставляя V=k+2e~ [уравнение (4.17)], получим

Для определения абсолютных значений констант скоростей необходимо знать концентрацию фермента, но даже если она неизвестна, можно найти отношение этих констант.

v

(4.362)

v

Рис. 4.76. Экстраполяция Км длж определения величины Ks-

Кинетика действия ферментов Во многих случаях с помощью методов исследования быстрых реакций удается изучать отдельные стадии суммарной реакции. Так, при наличии удобного метода регистрации образования комплекса можно изучать связывание аналогов субстрата, которые действуют как конкурентные ингибиторы. Например, Халфорд и др. [1752] исследовали связывание с щелочной фосфатазой (КФ 3.1.3.1) ингибитора 2-гидрокси-5-нитро-бензолфосфоната, регистрируя изменения спектра поглощения ингибитора, которые происходят при его связывании. Результаты, полученные методом остановленной струи, показали, что связывание является двухстадийным процессом; после образования комплекса происходит медленное конформационное изменение. Другой подход при изучении связывания состоит в регистрации процесса вытеснения одного субстрата другим. Было показано, что конкурентный ингибитор химотропсина профла-вин изменяет свой спектр поглощения при связывании с ферментом; используя это обстоятельство, за связыванием субстрата следили спектрофотометрически по вытеснению связанного красителя [530]. Аналогичная методика применялась в случае алкогольдегидрогеназы печени: регистрировалось вытеснение связанного с ферментом NADH избытком NAD+ [4260]. Результаты исследования показали, что диссоциация NADH из комплекса является лимитирующей стадией, поскольку рассчитанное значение константы скорости стадии диссоциации оказалось близким к тому, которое было получено для константы скорости стационарной стадии суммарной реакции в тех же самых условиях. Вопросы, касающиеся методов исследования парциальных реакций, детально рассмотрены Гутфрейндом [1721, с. 203].

Релаксационные методы

Как упоминалось выше, разрешаемое время быстрых струе-вых методов ограничено скоростью смешивания двух реагентов; по техническим причинам время смешивания оказывается не меньшим, чем примерно 1 мс. Таким образом, для исследования более быстрых реакций необходимо использовать другие методы. Когда реакции инициируются светом, разрешаемое время существенно уменьшается, однако этот подход применим только в ограниченном числе случаев. Более общим подходом является регистрация перехода системы в состояние равновесия после относительно небольшого возмущения. С помощью релаксационных методов можно регистрировать скорости реакций, на 7 порядков более быстрых, чем те, которые регистрируются струевыми методами [1212].

Возмущение может быть либо одиночным, либо периодическим; в настоящее время значительно чаще используется первый вариант, на нем мы и остановимся. Глава 4

Возмущение может быть создано разными способами, но наиболее широко используют два из них. Первый состоит в быстром изменении температуры (температурный скачок), а второй— в быстром изменении давления (скачок давления). Устройство прибора, обычно использующегося в методе температурного скачка, схематически изображено на рис. 4.77. Температуру раствора повышают, пропуская через него электрический разряд; при этом необходимо использовать растворы с относительно высокой ионной силой (больше чем примерно Ю-2 М), поскольку нагревание происходит в результате трения между заряженными частичками, ориентирующимися в поле. В таком аппарате температуру раствора можно повысить на 5° в течение 10 мкс. Поскольку время регистрации относительно невелико (обычно меньше 1 с), последующим охлаждением раствора можно пренебречь. В случае растворов с низкой проводимостью можно использовать другие методы нагревания, например вспышку лазерного излучения.

Для создания скачка давления либо резко снижают давление в системе примерно от 50 атм до атмосферного, либо создают ударную волну давления 500—1000 атм (см. [1847]). Ясно, что температурный скачок сопровождается изменением давления и наоборот, однако при сравнительно небольших изменениях параметров эти вторичные эффекты обычно оказываются несущественными.

Для системы, находящейся в равновесии, например

В,

(4.363)

Источник высокого напряжения

X

Конденсатор

Кювета \г- Электрод

Монохроматический свет------

Проба

Искровой промежуток

-о о—

—н ь

Фотоумножитель

Выключатель

Осциллограф

Рис 4.77. Схема устройства, используемого в методе температурного скачка; нагрев осуществляется за счет джоулева терла [1751]. Более детально изображена кювета, в которой содержится проба. Релаксационный процесс регистрируется спектрофотометрнчески с выводом данных на осциллограф. Специальный выключатель позволяет начать регистрацию в тот момент времени, когда через раствор проходит электрический разряд.

Кинетика действия ферментов имеет место следующее соотношение между константой равновесия реакции и температурой:

d In К. ЛЯ"

йТ RT*

(4.364)

где Д#°— стандартное изменение энтальпии в результате реакции. В случае возмущения, вызываемого скачком давления, соотношение между константой равновесия и давлением имеет вид

d In Ks A V

dP RT

(4.365)

где P — давление, AV° — изменение объема в ходе реакции.

Далее мы остановимся только на регистрации изменений, сопровождающих температурный скачок, однако все приведенные уравнения применимы и к процессам релаксации, которые следуют за скачком давления или другим кратковременным возмущением.

После кратковременного возмущения, которое вызывает небольшое смещение химического равновесия, изменение концентрации каждого из реагентов подчиняется простой экспоненциальной зависимости, каков бы ни был порядок реакции. Например, для системы (4.363) изменение концентрации В описывается уравнением

-uT=Ki(ao—b)—k-ib=Kiao—(Ki+k-i)b> (4-366)

где а0 — суммарная концентрация А плюс В. Если обозначить равновесную концентрацию В через beq, то можно записать для состояния равновесия

*+i(Oo-M = *-Aq- (4-367)

Рассматриваемое положение равновесия — это то новое равновесие, которое устанавливается после скачка, а не исходное равновесие (до скачка), и величины k+\ и k-i (которые изменились при изменении температуры) также относятся к новым условиям.

Отклонение Ь от конечной равновесной величины равно АЬ = Ьщ—Ь; тогда

-Т=-аГ =Mo-(*+i+*-i) (*е,-А*)- (4-368)

Из двух последних уравнений следует, что

-^r = -(*+i + *-i)A*. (4.369) Глава 4

Проинтегрировав это уравнение и подставив Ab = \bo при г=0, получим

1п-^г=(А+1 + М'. (4-370>

или

in -^-=4, (4.371)

где т—константа, называемая временем релаксации, которая в данном случае определяется соотношением яде

(4.373)

Уравнение (4.369) можно, следовательно, записать в виде

аДЬ ЛЬ

или в интегральной форме

Ab=Ab0e-V\ (4.374)

Следовательно, т можно определить таким же путем, как константу скорости первого порядка, по наклону графика зависимости \п{АЬ0/АЬ) от времени [уравнение (4 371)]. Такой подход справедлив только при условии, когда Ab0<^.b, т. е когда возмущение очень мало.

Рассмотрим реакцию связывания субстрата

E + S=P=fcES. (4 375)

*-i

Обозначим через ещ, seq и xeq равновесные концентрации фермента, субстрата и комплекса ES, устанавливающиес

страница 62
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Ферменты. Том 1" (3.77Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Химический каталог

Copyright © 2009
(11.08.2020)