Биологический каталог




Ферменты. Том 1

Автор М.Диксон, Э.Уэбб

, то количество продукта оказывается равным е.

Для рассмотренной выше системы предполагалось, что образование ES происходит очень быстро и что концентрация субстрата является насыщающей, так что фактически весь фермент вначале находится в составе комплекса ES. Следует также отметить, что молярная концентрация фермента во всех рассматриваемых случаях сравнительно велика, так что измет нение измеряемых параметров оказывается достаточно боль^ шим. Продукт, образование которого исследуется, не обязательно должен быть свободным, регистрироваться может и связанный с ферментом продукт, причем эта форма продукта может присутствовать в значительном количестве.

В качестве примера можно привести работу Шора и Гут* фрейнда [4260], в которой изучали образование NADH, катализируемое алкогольдегидрогеназой печени лошади. Исподь*

.276

Глава 4

зуя очень высокие концентрации NAD+ и этанола, авторы могли пренебречь стадией связывания, протекающей в соответствии с кинетикой второго порядка, и исследовать реакцию

E.NAD+.Этанол :?=*: Е.КАВД.Ацетальдегнд -*¦

-*¦ E.NADH -> Е -f- NADH,

регистрируя образование NADH спектрофотометрически по методу остановленной струи Результаты показали, что за начальным всплеском образования NADH следует более медленная стационарная стадия (рис 4 73). Это объясняется тем, что спектрофотометрический метод регистрирует как свободный, так и связанный с ферментом NADH, а также тем, что высвобождение NADH является лимитирующей стадией; в результате система оказывается аналогичной системе (4 351). Анализ обоих участков кривой позволяет определить скорость образования и распада комплексов фермент— NADH.

Если вместо образования продукта реакции (4.351) можно регистрировать образование ES, то, определяя скорость образования ES в предстационарном периоде, мы увидим, что концентрация этого комплекса увеличивается, достигая стационарного уровня, который сохраняется в течение той «линейной» <фазы, на которой определяется начальная скорость реакции. Концентрацию х комплекса ES для предстационарного периода можно найти с помощью уравнений (4 14) и (4 15); обозначив 'через Хо стационарную концентрацию ES, имеем

*о=-гггпт-Г=-^—s- (4-354)

+i

Изменение концентрации ES в предстационарном периоде описывается уравнением

1 +

^l_e-fe+A%s+s)). (4.355)

Следовательно, концентрация х при больших значениях t примерно равна х0; вклад экспоненциального члена существен только при очень малых t.

В литературе опубликованы результаты анализа более сложных односубстратных реакций Общие уравнения для таких систем суммированы в работах Хамадеса и Шиммеля [1755], а также Лайдлера и Бантинга [2686]

Методы исследования быстрых реакций могут, конечно, привлекаться и для изучения ферментативных реакций, в которых участвует более одного субстрата, как это видно на примере рассмотренной выше реакции, катализируемой алкогольдегид-

Кинетика действия ферментов рогеназой. Фактически впервые этот метод был использован для исследования ферментативных реакций Чансом [726], который работал с пероксидазой (КФ 1.11.1.7)—двухсубстратньгм ферментом, функционирующим по упорядоченному кинетическому механизму. Пероксидаза является гемсодержащим ферментом, спектр поглощения которого, как известно, изменяется при связывании с субстратом, Н202 Этот объект обладает еще одним преимуществом, которое состоит в том, что в отсутствие донора водорода комплекс ES может образоваться и существовать без протекания пероксидазной реакции. Благодаря этому комплекс ES можно изучать как в условиях равновесия, так и по ходу реакции. Более того, в присутствии такого донора, как лейкомалахитовый зеленый, пероксидазную реакцию можно исследовать спектрофотометрически по появлению у раствора зеленой окраски. Применение струевого метода позволяет измерить концентрацию1 комплекса ES и количество образовавшегося продукта в течение очень короткого периода времени (около 2 с) после смешивания; при работе с очень малыми количествами реагентов реакция за это время обычно завершается.

Смешивание фермента с Н2О2 в отсутствие донора водорода и определение изменения х во времени показали, что связывание происходило очень быстро и практически полностью. Константа скорости бимолекулярной реакции k+x оказалась равной 1,2-107 л/(моль-с). Максимальное значение константы равновесия Ks было равно 2-Ю-8 моль/л; следовательно, k-\ составляло 0,2 с-1 или меньше.

Если в смеси присутствуют одновременно фермент, субстрат и донор водорода, то имеют место следующие реакции-

Скорость реакции (4.357) будет, следовательно, пропорциональна концентрации Ь донора АН2. При данной концентрации донора удобно анализировать реакцию, считая ее мономолекулярной реакцией с константой скорости k+2; следовательно, k+2 зависит от концентрации донора, так что

где k'+2 — истинная константа скорости бимолекулярной реакции.

Величину k+2 можно найти двумя разными способами. Если скорость окисления донора (v) и концентрацию комплекса ES

1 В более поздних работах было показано, что в реакции участвуют два различных комплекса фермента с перекисью водорода и что активный комплекс образуется в результате двух последовательных реакций, которые, однако, могут рассматриваться как одна реакция. Механизм реакции обсуждается детально в гл. 7.

ES + АН,

* ES,

±: Е + А + 2Н20.

(4 356) (4.357)

(4.358) Глава 4

(х) определять одновременно, то k+2 может быть вычислена из

уравнения

v=k+2x. (4.359)

Типичный результат опыта с пероксидазой представлен на рис. 4.74. Кривые А и Б были сняты одновременно. Из рис. 4.74,5 видно, что комплекс образуется быстро и что концентрация его в течение непродолжительного времени остается постоянной, а затем падает по мере исчерпания субстрата. Скорость образования продукта, которая определяется наклоном кривой на рис. 4.74, Л, изменяется, как это можно видеть, пропорционально концентрации комплекса. Она увеличивается в период образования комплекса, достигает максимума ко времени, соответствующему максимуму кривой на рис. 4.74,5, и затем 'медленно спадает до нуля. Определив v из кривой рис. 4.74, Л и х из кривой рис. 4.74, ? для данного момента времени, можно найти k+2 из уравнения (4.359).

Второй метод определения k+2 состоит в измерении площади, ограниченной кривой рис. 4.74, ? и осями координат. Так как количество донора водорода, окисляемого за короткий промежуток времени dt, равно, согласно уравнению (4.359), k+2xdt, то полное количество окисленного донора будет равно

оо

k+2 j xdt. Этот интеграл равен площади под кривой на рис.

о

4.74, Б. Считая, что полное количество окисленного донора равно s0, т. е. исходному количеству перекиси водорода, которое нам известно, имеем О 1,0 2,0 0 1,0 2,0

Бпеия г Время, с

Рис. 4 74. Кривые, описывающие кинетику действия пероксидазы (К Ф 1.11 1.7), полученные по методу Чанса [726]. Начальные концентрации: 10_вМ пероксидазы хрена, 4 -10—6 М Н20г, 15-10~6 М лейкомалахитового зеленого. Ацетатный буфер, рН 4,0. А. Количество образовавшегося продукта. Б. Изменение концентрации комплекса пероксидаза—перекись водорода. Кружки — экспериментальные точки; кривые построены по расчетным данным.

Кинетика действия ферментов Б

Время, прошедшее после смешивания, с [Аскорбат] 10 6М_

Рис. 4.75. Кривые, описывающие кинетику действия пероксидазы [726]. Начальные концентрации: 10_e М пероксидазы хрена, 4-Ю-6 М Н202. Ацетатный буфер, рН 4,2. А. Экспериментальные кривые (числа у кривых указывают концентрацию аскорбата). Б. Определение, величин k+2 по второму из двух методов, описанных в тексте.

откуда можно определить k+2. Этот метод не связан с измерением количества продукта окисления и может применяться и в том случае, если доноры водорода дают бесцветные продукты. На рис. 4.75, Л представлены данные нескольких типичных опытов с аскорбиновой кислотой в качестве донора водорода, а на рис. 4.75,5 приведена прямая, связывающая рассчитанные значения k+2 с концентрацией донора водорода; величина k'+2, согласно этим данным, равна 1,8-105 л/(моль-с).

Зная три константы скорости, k+\, k-\ и k+2, можно рассмотреть значение Км для данного фермента. Подставляя в уравнение (4.19) значения соответствующих величин, полученные из опыта, результаты которого представлены на рис. 4.74, находим Км= (0,2+4,2)/1 • 107, или 4,4-10—7 М. Это значение близко к величине 5-10 7 М, рассчитанной для этих условий по данным Манна [2963] в предположении, что Км пропорциональна концентрации донора водорода, как это и должно быть в том случае, когда величиной k-\ вследствие малости можно пренебречь.

Км можно также определить по максимальному значению величины х с помощью уравнения (4.15). Преобразуя это уравнение и обозначив максимальное значение х, которое соответствует стационарному состоянию, через хтах, имеем

/(м = (е~^т;хх)ат. (4.361)

Величина ат, т. е. концентрация перекиси водорода при х= =*тах, равна площади под участком кривой зависимости х от t, огра

страница 61
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Ферменты. Том 1" (3.77Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(18.07.2018)