Биологический каталог




Ферменты. Том 1

Автор М.Диксон, Э.Уэбб

ации 60 и с0 равны нулю и, следовательно, ао = а + Ь + с, можно записать

:a41+^=^("+2e"+1~"+ie"+2')

(4.336)

Таким образом, уравнения (4.332), (4.335) и (4.336) описывают изменение во времени концентрации всех трех реагентов; полный анализ системы для определенных значений k+\ и k+% проведен с помощью ЭВМ Гутфрейндом [1721] (см. рис. 4.71). Распад А представляет собой простой процесс первого порядка, и, следовательно, k+\ легко определить из (4.332). Начальный наклон кривой, соответствующей образованию В, определяется той же самой константой скорости, однако ход кривой отличается от такового для простой реакции первого порядка: концентрация В достигает максимума при k+ia = k+2b. Таким образом, если регистрировать одновременно изменения а и br то нетрудно найти k+\ и k+2.

При максимальном значении b

— = 0 = k+la — k+2b.

(4.337)

\_Кинетика действия ферментов _271

Следовательно, скорость убыли А равна скорости образования С Далее имеем

и из (4.332) получаем

*+2

k+1 „-k,j

(4.338)

b=-.a0^-e-R^, (4.339)

«+2

так что

С=а0[1-е-^(1+|±Я]. (4-340)

Рассмотренное на рис. 4.71 стационарное состояние является относительно короткоживущим, хотя, конечно, можно подобрать такие константы скорости, что время его жизни будет больше. Кривые, описывающие изменение концентрации реагентов системы (4 331), упрощаются, если одна из констант скорости значительно больше, чем другая; в таком случае образование С будет описываться кривой первого порядка, определяемой только меньшей из двух констант, или другими словами, скоростьлимитирующей стадией.

Гутфрейнд [1721] и Роутон [4004] рассмотрели простую ферментативную реакцию

k k

E+S zjk ES E + P. (4.341)

*-i

Скорость образования фермент-субстратного комплекса (концентрация которого обозначена через х) определяется уравнением

¦Щ-=k+les-(k+is +k_, -И+2) х. (4.342) Обозначив через р концентрацию продукта, запишем

w=-ar = ^, (4-343)

тогда

(4-344)

Из (4 342) и (4 344) получим

-g- + -*Ц- (fc+ts + AL,+M-Miri«~<>. (4.345)

Решение этого уравнения, которое применимо как к начальному периоду, так и к стационарному состоянию до тех пор, по-

ка изменение s можно считать малым по сравнению с его начальной величиной s0, имеет следующий вид:

(4.346)

где р0 — начальная концентрация продукта (эта величина входит в уравнение, так как определявшийся Гутфрейндом продукт представлял собой ион водорода) Разлагая экспоненциальный член в ряд, в котором при очень малых t всеми членами после третьего можно пренебречь, получаем более простое уравнение, применимое только к начальной фазе ускорения реакции:

р-р„ = . (4.347)

Таким образом, измеряя р в течение этой начальной фазы реакции, можно найти величину k+\k+2 е. Определив V, мы в соответствии с уравнением (4 17) получим значение k+2e и далее сможем вычислить величину k+и в то же время, определив /См, мы найдем величину (k-\ + k+2)lk+\ Зная эти величины и концентрацию фермента, можно рассчитать все три константы скорости.

Уравнение (4.346) можно использовать и другим путем [1718]. Если построить график зависимости р—р0 от t, то получится определенной формы кривая, приведенная на рис 4.72. Кривизна ее является следствием наличия экспоненциального члена; когда t становится достаточно большим, так что этим членом можно пренебречь кривая приближается к пунктирной

\_Кинетика действия ферментов_273S

прямой^ (см рис. 4.72), описываемой уравнением

Если концентрация субстрата достаточно высока для насыщения фермента (so велико по сравнению с Км), то данное уравнение сводится к

p-Po=k+zet-^~. (4.349>

Длина отрезка, отсекаемого прямой от оси абсцисс (т), которую можно получить в результате подстановки р—/Л> = 0, равна

*=yV (4.350)

Таким образом, измерение т позволяет непосредственно определить k+i

Применимость рассмотренных выше уравнений связана с допущением, что Кш определяется выражением (4 19) Бриггса— Холдейна Эти уравнения применимы к системам с одним промежуточным комплексом ES, в которых k+i представляет собой константу скорости образования этого комплекса, распадающегося с образованием продукта реакции, и неприменимы к системам, в которых имеются два или более промежуточных комплекса В таких случаях комплекс ES, образующийся в результате реакции с константой скорости k+\, отличается от комплекса, в результате распада которого образуется продукт реакции Скорость образования продукта реакции при этом не обязательно пропорциональна концентрации комплекса ES, а выражение для Км имеет более сложный вид Скорость образования продукта может лимитироваться одной из промежуточных стадий, например реакцией с константой скорости k+з. В этом случае величина 1/т не будет являться мерой k+\, а будет зависеть от k+3 и, возможно, также от других констант

Это, однако, легко проверить, так как свободный субстрат не участвует в последующих стадиях и соответствующие выражения не содержат so Таким образом, если установлено, что т пропорционально l/s0, то уравнение (4 349) можно считать-применимым и с его помощью можно определить k+u если же т не зависит от so, то тогда оно зависит от одной из промежуточных констант (однако не всегда известно, от какой именно).

Гутфрейнд [1717, 1718] исследовал ряд реакций гидролиза синтетических эфиров аминокислот, катализируемых протеоли-тическими ферментами При гидролизе этилового эфира бен-зол-Ь-аргинина трипсином (КФ 3 4 21 4) было найдено, что-?+1>4-106, а /е+2=15 с-1. Так как Ки=Ю~5 [393], k-X должно быть больше 25 с-1; но это только минимальное значение, и,

18—2277 Глава 4

возможно, что в действительности величина k-\ значительно превышает его. При гидролизе этилового эфира ацетил-Ь-фенил--аланина химотрипсином (КФ 3.4.21.1) k+\ оказалось больше 106, k+2 было равно примерно 10 'с-1, а /См = 10-4; поэтому ?_i должно быть больше 90 с_! [1722]. При гидролизе этилового эфира бензоил-Ь-аргинина фицином (КФ 3.4.22.3) k+i составляла 5-Ю2, Км. = 1,5-10~2 и '?+2' = 1,5 с-1; отсюда k-X должно 'быть равно 6 с-1 ('k+2 здесь по-прежнему есть константа скорости, определяющая скорость распада ES; в кавычки же эта величина взята потому, что в присутствии фицина расщепление, вероятно, осуществляется в две стадии, и скорость распада может определяться второй из них, так как '&+2' имеет одинаковое значение для гидролиза амидов и гидролиза эфиров [1760]).

Во всех этих случаях ?+2 значительно меньше k-\, так что Къ1 практически равно Ks- Совпадение может быть даже более полным, чем это явствует из приведенных выше данных, так как, за исключением гидролиза под действием фицина, для k-i были определены только минимальные значения. Отсюда можно заключить, что для действия этих ферментов, особенно химотрипсина, справедливо первоначальное допущение Михаэлиса.

Следует отметить, что начальная фаза ускорения реакции, которую исследуют данным методом, столь кратковременна, что она не может быть обнаружена обычными способами. Выражение «начальная скорость», которым мы пользовались до сих пор, относится не к этой фазе, а к стационарной скорости, устанавливающейся после образования комплекса ES.

В ряде случаев, например при гидролизе п-нитрофенилаце-тата, катализируемом химотрипсином (с. 264), наблюдается начальный всплеск образования продукта, затем следует начальная фаза ускорения, далее реакция замедляется и достигается стационарная скорость. Как отмечалось выше, такое поведение может наблюдаться в системах типа

k+l k+2 k+3

Е <—> ES ->EP+Q -> E + P, (4.351)

*-i

если регистрируют образование Q, а освобождение P является лимитирующей стадией. Оно свойственно некоторым гидролитическим ферментам; соответствующие уравнения приведены в ряде работ (см., например, [1721, с. 199 и далее, 1751, 5290, с. 74 и далее]).

Уравнение для образования Q в интегральной форме имеет вид

'=«[^tr'+(^7)*(,-e"(i"+*")')]' (4'352)

Кинетика действия ферментов Рис. 4.73. Динамика образования Q в системе (4.351). Ъ — количество Q, высвобождающегося при всплеске.

Кривая, отвечающая такому уравнению (при допущении, что-образование ES является быстрой стадией), приведена на рис. 4.73. Ее можно представить в виде суммы двух кривых, соответствующих двум членам, находящимся в квадратных скобках [уравнение (4.352)]. Линейная часть соответствует первому члену, который отражает освобождение Р из ЕР; на эту часть кривой налагается начальный экспоненциальный всплеск, соответствующий второму члену и отражающий начальное связывание фермента с субстратом, которое сопровождается освобождением эквивалентного количества Q. Это количество можно определить путем экстраполяции линейной части кривой к нулевому моменту времени; таким образом можно выразить концентрацию фермента через концентрацию функционально активных центров. Подставляя ^ = оо во второй член, находим, что

Количество освобождающегося при вплеске продукта =

-(xrfc-)'- <4-353>

Если третья стадия реакции является гораздо более медленной, чем вторая

страница 60
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Ферменты. Том 1" (3.77Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(10.12.2018)