Биологический каталог




Ферменты. Том 1

Автор М.Диксон, Э.Уэбб

редотвращения заметного изменения рН в тех случаях, когда в результате реакции образуется кислота. По возможности следует выбирать условия, при которых фермент достаточно стабилен: температура не должна быть слишком высокой, и величина рН должна поддерживаться в пределах зоны стабильности фермента. Данное требование, однако, не всегда удается соблюдать при изучении фермента в широком диапазоне условий.

Методика работы с ферментами Так как ферменты обладают высокой каталитической активностью, особое внимание следует обращать на то, чтобы по небрежности не внести их следы в реакционный сосуд на кончиках пипеток или в виде ныли при работе с сухими препаратами ферментов, или, наконец, со следами слюны в пипетках, При работе с амилазами верхний конец пипеток непременно следует затыкать ватой.

Скорость реакции следует всегда предварительно отрегулировать (путем подбора количества взятого в опыт фермента) с таким расчетом, чтобы измерения могли быть проведены надлежащим образом. Ферменты обычно хранят в высококонцентрированных исходных растворах, очень небольшие объемы которых используют для определения активности. Поэтому все более широкое применение для внесения фермента в опытную смесь получают различные микрошприцы, с помощью которых можно отбирать объемы порядка 0,005 мл. При запуске реакции путем добавления либо фермента, либо одного из других компонентов реакции необходимо тщательно и быстро перемешивать смесь.

При спектрофотометрических исследованиях можно использовать небольшие пластиковые плунжеры, имеющие на верхней поверхности углубление, в которое помещают вносимый раствор; добавление раствора и перемешивание достигается однократным опусканием плунжера в кювету.

ОБЩИЕ ПРАВИЛА РАБОТЫ С ФЕРМЕНТАМИ

Ферменты — относительно неустойчивые вещества; при неблагоприятных условиях они легко денатурируются и инактиви-руются. Поэтому в работе с ферментами всегда следует прежде всего заботиться о том, чтобы не допустить их инактивации. Сравнительно жесткие воздействия (сильные кислоты, высокая температура, сильнодействующие реагенты и т. д.), часто' используемые в органической химии, мгновенно разрушают ферменты. Таким образом, воздействия, которым могут быть подвергнуты ферменты, строго ограничены пределами их стабильности.

Успех при работе с ферментами зависит от соблюдения условий, при которых ферменты остаются стабильными. Эти условия для разных ферментов различны, но всегда следует избегать высоких температур, а также растворов с выраженной кислотной или щелочной реакцией. Рекомендуется (там, где это возможно) не подвергать ферменты воздействию температуры, превышающей температуру тела. В настоящее время при очистке многих ферментов поддерживают температуру 0°С как само собой разумеющееся условие. Использование для этой цели бани с охлажденным спиртом предпочтительнее, чем работа в Глава 2

холодной комнате, не только потому, что при этом создаются более комфортабельные условия для работающего, но также и потому, что сосуд с жидкостью, погруженный в подобную баню, охлаждается очень быстро, в то время как в холодной комнате, будучи окружен плохо проводящим тепло воздухом, он охлаждается относительно медленно. Для работы при 0°С сосуды из нержавеющей стали (вследствие их высокой теплопроводности) предпочитают стеклянным.

Большинство ферментов инактивируются в растворах с рН<5 или >9, хотя из этого правила имеются исключения. Поэтому важно, чтобы при доведении рН раствора фермента до определенного значения путем добавления кислоты или щелочи вокруг каждой капли добавляемого к раствору реагента не возникало зоны деструкции. Реагент следует добавлять медленно, давая ему стекать по стенке сосуда, и одновременно энергично перемешивать раствор, желательно с помощью механической мешалки. Добавление реагента следует производить, если это возможно, при 0°С.

Многие ферменты подвергаются денатурации на поверхностях раздела. Поэтому важно избегать образования пены — переливать раствор фермента из одного сосуда в другой следует по стенке сосуда. По той же причине не следует употреблять мешалки, вспенивающие поверхность жидкости. Лопасти мешалки должны быть глубоко погружены, и поток жидкости должен быть относительно спокойным. Иногда возникают трудности при фракционировании сульфатом аммония, если соль добавляется в сухом виде, так как при этом растворенный в жидкости воздух «высаливается» в виде мелких пузырьков и вызывает денатурацию фермента. Это затруднение встречается редко, но если оно имеет место, то его можно преодолеть, добавляя соль в виде насыщенного раствора.

Органические растворители, например спирт, инактивируют большинство ферментов при комнатной температуре, если только они не применяются в достаточно низких концентрациях. Поэтому фракционное осаждение ферментов спиртом или ацетоном необходимо проводить при возможно более низкой температуре, следя за тем, чтобы раствор не нагревался в результате выделения тепла при смешивании растворителя с водой. Ни одной из полученных фракций нельзя давать нагреваться даже на несколько градусов, пока растворитель не будет удален или пока в результате разведения концентрация его не станет безопасной.

Иногда для солюбилизации ферментов используют детергенты (гл. 3); однако в некоторых случаях они оказывают повреждающее действие на фермент, и, как правило, их очень трудно впоследствии удалить.

Методика работы с ферментами Отделение осадков путем центрифугирования обычно предпочитают фильтрованию, и центрифуга с охлаждением — незаменимый предмет лабораторного оборудования. В некоторых случаях, однако (например, в условиях высоких концентраций сульфата аммония, когда различие в плотностях между твердой и жидкой фазами слишком мало для того, чтобы можно было эффективно разделить их центрифугированием), следует предпочесть фильтрование с помощью фильтрующих средств, таких, как бумажная пульпа, целит, суперсел и т. п.

Во многих случаях даже при наиболее благоприятных условиях наблюдается медленное инактивирование фермента при стоянии. Поэтому рекомендуется проводить очистку фермента по возможности быстро, заканчивая выделение в течение 2— 3 дней, если только фермент не является достаточно устойчивым.

Иногда возникают трудности в связи с необходимостью сохранять ферменты в лаборатории без потери активности. Если раствор фермента можно подвергать замораживанию и оттаиванию без потери активности, то удобнее всего хранить его в состоянии глубокого охлаждения; при этом он обычно остается стабильным в течение многих месяцев. Некоторые ферменты стабильны в концентрированных растворах солей; их можно длительное время сохранять без потери активности в форме осажденных суспензий в насыщенном растворе сульфата аммония, с тем чтобы, когда это понадобится, отцентрифугировать и растворить в воде.

Высушивание растворов ферментов при комнатной температуре обычно вызывает полную инактивацию, но высушивание в условиях высокого вакуума при низкой температуре из замороженного состояния представляет собой ценный метод; с помощью этого метода часто удается получать активный растворимый препарат, который можно хранить при комнатной температуре.

Бактериальное загрязнение растворов ферментов в период проведения самих процедур фракционирования обычно не представляет опасности, но если раствор оставляют стоять на продолжительное время на какой-либо из стадий очистки, то необходимо принимать соответствующие ,меры предосторожности.

ИССЛЕДОВАНИЕ ФЕРМЕНТА

Всестороннее изучение фермента связано с исследованием целого ряда его характерных свойств. Нижеследующий перечень может дать представление о том, какие именно свойства имеются в виду. Однако необходимо ясно представлять, что в действительности имеется очень мало ферментов, охарактеризованных достаточно полно с учетом перечисляемых ниже свойств. Глаза 2

Свойства белка: гомогенность; число изоферментов; константы седиментации и диффузии; молекулярная масса; форма молекулы (отношение осей); кривая титрования; изоэлектрическая точка; электрофоретическая подвижность; степень гидратации; стабильность но отношению к изменениям рН, нагреванию, окислению и облучению; диссоциации на субъединицы; спектр поглощения и т. д.

Структура: аминокислотный состав; число пептидных цепей; последовательность аминокислот; укладка цепей и трехмерная структура молекулы (если могут быть выращены требуемые кристаллы); наличие простетической группы, специальной группы или атома металла; число простетических групп в молекуле фермента; их природа и характер присоединения; число SH-групп и их влияние на активность фермента; действие химических реагентов; спектры дисперсии оптического вращения, кругового дихроизма (КД), ЯМР- и ЭПР-спектры (см. список сокращений). | *

Свойства фермента: природа катализируемой реакции; в случае если в реакции участвует кофермент — его природа и тип действия; субстратная специфичность; особенности химической структуры субстрата, необходимые для связывания с ферментом, а также для осуществления реакции;

страница 6
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Ферменты. Том 1" (3.77Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(24.09.2018)