Биологический каталог




Ферменты. Том 1

Автор М.Диксон, Э.Уэбб

х у- Комплекс ES < > 4 ¦ > Пара нитрофенол -4- Ацетил-Е, Лцетил-Е 4- Н20 = Е + Ацетат. (4.303)

Стадию образования ацетил-Е можно исследовать, регистрируя спектрофотометрически при щелочных рН освобождение n-нитрофенолят-иона, придающего раствору желтую окраску. Временной ход такой реакции при различных концентрациях химотрипсина показан на рис. 4.70 (медленно реагирующим субстратом здесь является л-нитрофенилэтилкарбоиат) (ср. с рис. 4.73). Сначала наблюдается быстрое освобождение л-нитрофенола, соответствующее образованию ацилфермента (в приведенном случае около 1,2 моль на моль фермента), затем следует медленная стационарная фаза, соответствующая лимитирующей стадии — гидролизу ацилфермента.

Анализ результатов исследований быстрых реакций

Используя адекватные методы регистрации, можно изучать изменение концентраций либо фермент-субстратных комплексов, либо свободного или входящего в состав комплекса продукта; анализ этих данных позволяет определить константы скорости отдельных стадий суммарной реакции. Для интерпретации результатов следует использовать кинетические уравнения для зависящих от времени процессов. Ранее в этой главе мы занимались в основном анализом влияния различных факторов на начальную скорость реакции; в этом разделе будут рассмотрены кривые, характеризующие временной ход реакции, для анализа которых применимы некоторые хорошо известные уравнения физической химии.

Для простой реакции

А —X В, (4.304)

являющейся реакцией первого порядка (т. е. реакцией, скорость которой пропорциональна первой степени концентрации А), имеет место соотношение

da ,

(4.305) Глава 4

Интегрируя это уравнение и обозначив через а0 начальную концентрацию А, получим

—in—=k+it = lna0—In а, (4.306)

а$

или

=а0е-*+Л (4.307)

Обозначив через b концентрацию В, имеем а = ао—Ь, так что

а0_й=а0е-^. (4.308) Если следить за образованием В, то можно записать

In а0—In (а0—b)=k+it = In bx—In (й»—b), (4.309)

полагая, что концентрация В равна нулю при t — О и boo при

Известны несколько методов графического анализа систем первого порядка; многие из них рассмотрены Лайдлером [2685]. Наиболее простой метод состоит в построении графика зависимости In а от t; если имеет место кинетика первого порядка, то получается прямая с наклоном —k+\. В координатах {г; lga} наклон прямой будет равен —2,303^+ь Если регистрируется образование В, для построения рассмотренного выше графика необходимо знать либо Ь™, либо do, однако определить эти величины с достаточной точностью не всегда удается. Полезный метод построения графиков первого порядка для случаев, когда не известны ни начальные, ни конечные концентрации компонентов, был предложен Гуггенгеймом [1701]. Сначала определяют b при значениях t, лежащих в достаточно широком интервале. Затем проводят вторую серию опытов, определяя Ь' при временах t + t', где ? — постоянный интервал времени. В случае кинетики первого порядка график зависимости (b—Ь') от t будет прямой с наклоном —k+\.

Для обратимой реакции первого порядка

А =г^= В (4.310) k-i

скорость образования В равна

Jj-=k+1a— к_ф =k+i (a0—Ь)—к_ф. (4.311)

В равновесии

*+1ам = *-1*еЯ» ИЛИ fc+i(ao—&eq)=*-Aq- (4-312)

Исключая а из двух последних уравнений, получаем

4-=(*+i+*-iK6eq-6). (4-313)

Кинетика действия ферментов Это выражение по виду есть уравнение первого порядка, но кажущаяся константа скорости первого порядка является суммой двух констант скорости первого порядка. Поскольку, однако, отношение этих констант равно константе равновесия, можно найти значение каждой константы в отдельности.

В другом варианте, если величина ао установлена достаточно точно, из уравнений (4.311) и (4.312) можно исключить k-u тогда

<4-314>

Если в момент времени г = 0 концентрация В равна нулю, после интегрирования получаем

М.\п . Ь^ . (4.315)

Таким образом, если известны beq и ао, то по изменению b во времени можно рассчитать k+\.

Рассмотрим теперь реакцию второго порядка

A-fB —Р. (4.316) Скорость образования Р равна

-%Г=К&- С4-317)

[Вместо В в реакции может участвовать вторая молекула А; в этом случае в (4.317) ab нужно заменить на а2.] Константа скорости второго порядка k+\ имеет размерность концентрация-1 • время-1 (обычно М-1-с-1), в то время как размерность константы скорости первого порядка — время-1 (обычно с-1).

Если в реакции участвуют две молекулы А, то интегрирование уравнения dp/dt = k+ia2 дает

-Г-тНМ- (4-318)

Таким образом, график зависимости 1/а от t будет прямой с наклоном k+\. Однако, когда А и В различны, интегрирование (4.317) приводит к более сложному уравнению:

-L_in-??=jfe+1f. (4.319)

a0 — b0 аф +1 v '

Если ао и 60 известны и регистрируется образование Р, то k+\ можно определить по графику зависимости р от t, поскольку а=а0—р, a b — b0—р. Обычно, однако, условия проведения опытов выбирают таким образом, что система упрощается. Одно

26S

Глава 4

I

_ m (4-322)

из таких условий — равенство начальных концентраций реагентов: если а0 = Ьо, то, очевидно, (4.319) упрощается до (4.318). При другом подходе используют очень высокую концентрацию одного из реагентов; например, если в (4.316) а>&, то за время протекания реакции концентрацию А можно считать постоянной. Тогда после интегрирования уравнения (4.319) получаем выражение

lnb0—lnb--=a0k+it=k'+it, (4.320)

которое есть уравнение псевдопервого порядка: константа скорости k'+i, определяемая по полулогарифмическому графику, является произведением константы скорости второго порядка k+i на а0.

Если реакция второго порядка обратима,

*« „

А+В^Р, (4.321) k-i

то при условии, что ао~bo, находим следующее выражение для скорости (в интегральной форме):

Peg jп РеЧ (Qo2 — Peg) _

a02~P2eq Oo2(Peq— Р)

Если в результате реакции образуются два продукта,

A + B = P + Q, (4.323)

то, принимая, что для любого момента времени ао=6о, р = а и р = 0 при t=0, находим, что

- in .Pfo-W+a.^ = k t /4.324)

2а0(ао— Peq) MPeq — P) + V '

Как обсуждалось выше, ферментативные реакции часто подчиняются кинетике первого порядка, но в тех условиях, при которых определяется скорость, их можно считать реакциями псевдонулевого порядка. Концентрация фермента-катализатора во время реакции остается постоянной, и если концентрация субстрата велика по сравнению с ^м, то уравнение Михаэлиса (4.16) упрощается до v = k+2e, которое является уравнением нулевого порядка. При низкой концентрации субстрата

-от—<4-325)

т. е. выражение для скорости является уравнением первого порядка. Поскольку, однако, начальная скорость определяется в течение малого интервала времени, так что s можно считать постоянной, реакция оказывается «линейной» (псевдонулевого порядка).

\_Кинетика действия ферментов 269

\--—

Следует учитывать и реакции, значительно более сложные, чем реакции второго порядка. Для реакции n-го порядка типа

*+i

пА -* пР (4.326)

уравнение скорости имеет вид

-4L=fc+1(a0-p)«. (4.327)

После интегрирования получаем

1Г^[Ъ^-Ф)=К* (4-328)

Столь сложные уравнения, однако, вряд ли можно применять при анализе реальных ферментных систем; чаще всего при использовании методов регистрации быстрых реакций приходится проводить разграничение между реакциями первого и второго порядков и определять соответствующие константы скорости. Различить реакции первого и второго порядков позволяют рассмотренные выше графические методы, поскольку линейность соответствующего графика является указанием на определенный порядок реакции.

Этой же цели может служить и еще один метод — определение полупериода реакции, т. е. времени превращения половины исходного количества реагента(ов). В случае реакций первого порядка полупериод (ti/%) можно определить, подставив й0/2 вместо а в уравнение (4.306). Тогда

^1/2 = ш2Д:+1 = 0,69/6+1. (4.329)

В данном случае полупериод не зависит от исходной концентрации А. Для реакции второго порядка 2А-^Р, подставляя й0/2=а в уравнение (4.318), находим

'*-*^Г! (4-330)

в этом случае полупериод тем больше, чем меньше ао.

Ситуации, рассмотренные выше, однако, значительно проще, чем те, которые встречаются при исследовании ферментативных реакций, проходящих чаще всего через ряд последовательных стадий. Простой двухстадийный процесс был рассмотрен Гутфрейндом [1721] и Халфордом [1751]. Для системы

A _U в -»- С (4.331)

можно записать уравнение, аналогичное (4.307):

га=а0е~кЛ, (4.332) Глава 4

/

/

Рис. 4.71. Изменение концентраций компонентов в системе А—*-—>-В—>-С. Кривые построены с помощью ЭВМ [1721]. Константы» скорости обеих стадий равны» 1 с-1; стадии считаются необра-

0 1 2 3 4 5 6 с тимыми

и поскольку

¦^f-=k+ia—k+2b, (4.333>

то

^-=k+ia0e-k^-k,2b. (4.334>

После интегрирования получаем

, . е +1 — е +2 b=Klao ь _ь--

(4.335>

Если исходные концентр

страница 59
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Ферменты. Том 1" (3.77Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(19.10.2018)