|
|
Ферменты. Том 1е соответствующие уравнения. Е. ПРЕДСТАЦИОНАРНАЯ ФАЗА ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИИ За исключением самых простых случаев, не представляется возможным определить значения констант скорости отдельных стадий ферментативных реакций, основываясь только на данных о начальных скоростях. Для определения этих величин используют два подхода В первом из них регистрируют ход реакции за очень короткий промежуток времени, предшествующий установлению стационарного (или равновесного) состояния на промежуточных стадиях; этот подход рассматривается в разделе «Методы исследования быстрых реакций». При втором подходе, скачкообразно изменяя условия, выводят систему из состояния равновесия, в котором она находилась, и следят за переходом ее в новое состояние равновесия; этот подход рассматривается в разделе «Релаксационные методы». Методы исследования быстрых реакций Выше при рассмотрении кинетики реакций в стационарных и равновесных условиях постулировалось, что в период исследуемой начальной фазы реакций концентрации фермент-субстратных интермедиатов остаются постоянными Однако установлению стационарного или равновесного состояния предшествует короткий период времени, в течение которого концентрации этих комплексов изменяются, и измерения в этот пере- Кинетика действия ферментов [PI 10 8 \[Е] [Е*Р]
6 -\ 4 \feS] +¦ [E*S] 2 S 1 0 Ю 20 30 АО 50 SO 70 Mic Рис. 4 67 Изменение концентраций интермедиатов и продуктов в предстацио- *+1 *+2 *+3 *+4 fe+5 нарном состоянии для системы E+S ES E*S =?* Е*Р ЕР *± Е+Р. Кри- вые построены с помощью ЭВМ [1720]. Суммарная концентрация фермента Ю-7 М. Исходная концентрация субстрата 10~5 М Константы k-u k-i, k-%, k^ меньше, чем 10 с~!. &+1=107 М~! с-1; ?+2=103 с-1, ?+з = Ю3 с-!, /г+4=» = 102 с-!; fc+5=10 с-1. ходный, или предстационарный, период позволяют определить константы скорости многих стадий Изучаемой реакции. На рис. 4.67 показаны изменения концентраций интермедиа' тов односубстратной реакции в период времени перед достижением стационарного состояния; они свидетельствуют о возможности получения прямой информации об образовании и распаде различных интермедиатов, в том числе тех, стационарная концентрация которых очень мала. Для регистрации процессов, происходящих в предстационар-иой фазе, используются несколько методов Исторически первым из них был метод непрерывной струи, разработанный Хартриджем и Роутоном [1809]. В этом методе два раствора продавливаются через смеситель, а затем через трубку, в которой регистрируется состояние реакционной смеси (рис. 4.68). Зная скорость жидкости и расстояние между смесителем и точкой наблюдения, можно найти время, прошедшее после смешивания, для раствора в любой точке трубки. Таким образом, измерения в различных точках трубки (при постоянной скорости жидкости) позволяют определять параметры системы через различные интервалы времени после смешивания В другом варианте измерения производят в одной и той же точке, но изменяют скорость жидкости, что также дает информацию о состоянии системы через различные промежутки времени после смешивания Позже был предложен метод, в котором реакционная смесь выдавливается из отверстия трубки в виде тонкой струи в орГлава 4 ганический растворитель при столь низкой температуре, что она практически мгновенно замерзает, и состав смеси фиксируется в тот момент, когда она выходит из трубки. До тех пор пока реакционная смесь находится при низкой температуре, ее состав остается постоянным, и определение содержания интермедиатов может быть проведено без ограничений во времени. Эта методика была разработана Брейем и др. [539, 541, 3594]; она использовалась, например, для детальных исследований интермедиатов в реакциях, катализируемых ксантиноксидазой. Интермедиаты регистрировали с помощью ЭПР-спектроскопин после фиксации реакционной смеси путем впрыскивания ее в изопентан при температуре —145 °С. Следует отметить, что метод непрерывной струи не требует использования безынерционного способа регистрации, поскольку «возраст» струи, протекающей около детектора, остается постоянным. Это позволяет применять относительно медленные системы детектирования; например, за ходом реакции, сопровождающейся выделением С02 [4005], можно следить с помощью ССуэлектрода, хотя время регистрации при этом значительно больше, чем продолжительность протекания изучаемой реакции. Недостаток метода непрерывной струи состоит в том, что он требует относительно больших количеств фермента, поэтому при исследовании ферментов чаще применяют метод остановленной струи, который был разработан Чансом и Гибсоном (см. [1438]) на основе метода непрерывной струи. Устройство, использующееся в методе «остановленной струи», схематически изображено на рис. 4.69. Как и в рассмотренном выше случае, растворы выдавливаются из двух шприцев через смеситель в камеру наблюдения. Затем смесь попадает в стоп-шприц, с помощью которого поток жидкости резко останавливается, и немедленно начинается регистрация (в течение определенного периода времени) соответствующих Смеситель Сток меняемого в методе непрерывной струи. Систему быстрой регистрации использовать иет необходимо- Рис. 4.68. Схема устройства, при- сти. Кинетика действия ферментов Лампа Моиохроматор \ Шприцы с раствором реагентов Т Смеситель Чш Подвижный толкатель Фотоумножитель Ограничитель Стоп шприц - 4 Камера наблюдения 1 ) К выключателю г (Л
Осциллограф Рис. 4.69. Схема устройства, используемого в методе «остановленной струи»; изменение поглощения света регистрируется на осциллографе [1751]. Камера наблюдения сконструирована так, чтобы длина оптического пути была оптимальной. параметров стационарной смеси в зоне наблюдения. Ограничитель, который останавливает поток жидкости, одновременно включает регистрирующий прибор, так что измерения параметров реакционной смеси (обычно с помощью осциллографа) могут быть сделаны с того момента, когда она остановилась в зоне наблюдения. Контролировать скорость вытекания жидкости из шприцев нет необходимости, однако время между моментом смешивания и поступления жидкости в зону регистрации должно быть гораздо меньше времени протекания исследуемой реакции, в противном случае начальную часть кривой хода реакции получить не удастся. Все это требует быстрого смешивания реагентов; в некоторых случаях поршни шприцев перемещают вручную, однако в более сложных приборах используется автоматическая система перемещения, например с помощью сжатого воздуха. Методы регистрации также должны быть достаточно быстрыми; часто для этой цели используют спектрофотометрию или флуориметрию. При исследовании предстационарной фазы ферментативных реакций наиболее часто применяют струевые методы; они позволяют регистрировать процессы, происходящие за время порядка миллисекунд. Иногда удается исследовать кинетику процесса в предстационарной состоянии, не прибегая к относительГлава 4 но сложным струевым методам, а инициируя реакцию вспышкой света. Такой метод был использован Гибсоном [1559] при изучении связывания окиси углерода с миоглобином после предварительной фотодиссоциации комплекса, а также при исследовании функционирования химотрипсина; в последнем случае очень плохой субстрат, л-нитрофениловый эфир п-нитро-^ыс-коричной кислоты, превращался в гораздо более эффективно атакуемый трамс-изомер при облучении фермент-субстратного комплекса вспышкой ультрафиолетового света [365]. Совершенно другой подход для изучения промежуточных соединений в предстационарной фазе был предложен в работе [1146]: автор проводил исследования при очень низкой температуре, чтобы замедлить процессы. Используя смеси органический растворитель — вода, можно проводить опыты при температуре —50 °С, при которой продолжительность предстационарной фазы значительно увеличивается. Однако такое изменение условий функционирования фермента может существенно повлиять на кинетический механизм, поэтому трактовать получаемые результаты нужно с осторожностью, если речь идет о действии фермента в «нормальных» условиях. К сожалению, до настоящего времени не проведено детального сопоставления результатов, полученных низкотемпературными и струевыми методами. Особый случай представляют системы, в которых фермент действует на очень плохой субстрат и стадии реакции столь О 4 8 12 мин Рис. 4 70 Гидролиз я нитрофенилэтилкарбоната при различных концентрациях химотрипсина, которые указаны справа от кривых [1801]. Концентрация субстрата 5-10—» М, рН 7,6, 20 °С. Кинетика действия ферментов медленны, что можно регистрировать образование промежуточ* иых соединений без применения специальных методов. Такая картина наблюдается при гидролизе л-нитрофенилацетата хи-мотрипсином [1801]: Е -f- я-нитрофенилацетат |
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 |
Скачать книгу "Ферменты. Том 1" (3.77Mb) |
[каталог] [статьи] [доска объявлений] [обратная связь] |