Биологический каталог




Ферменты. Том 1

Автор М.Диксон, Э.Уэбб

пловому эффекту. Аналогичные расчеты могут быть проведены для свободной энергии и энтропии.

Фумаратгидратаза — единственный фермент, для которого имеются в этом отношении достаточно полные данные [ЗОН]. На рис. 4.66 графически представлены полученные экспериментальным путем значения АЯ для фумаразной реакции в кислой среде, причем можно убедиться, что эти величины хорошо согласуются между собой в пределах ошибки опыта. Это относится к обеим кривым для двух различных температурных областей, в которых, как отмечалось выше, действуют различные фермент-фумаратные комплексы

Те же данные для фумаратгидратазы приведены также (вместе со значениями величин AG и AS) в табл. 4 12. Следует помнить, что, в то время как значения АЯ рассчитаны по наклонам графиков для V и Км, которые постоянны в определенном интервале температуры, но резко изменяются при критической температуре, AG определены по действительным значениГлава 4

25-

Рис 4 65 Влияние температуры на Ki для ингибиторов фумаратгид-ратазы в кислом растворе [3012]. Для прямой и обратной реакций были получены одинаковые значения Ki. I — граяс-аконитат; II — сукцинат; /// — малонат.

"ям V и Км, которые непрерывно изменяются с температурой о"ез какого-либо резкого изменения в указанной точке. Поэтому величины AG следует вычислять для какой-либо определенной температуры; в табл. 4 12 приведены значения AG для 18°С.

Было высказано предположение, что удовлетворительные результаты проверки путем суммирования соответствующих величин, иллюстрируемые рис 4.66, доказывают, что для фу-маратгидратазы Kk^Ks, а V является функцией одной из констант скорости (такие именно допущения и были сделаны при расчете АН). Однако это не так. Подобных результатов суммирования следует ожидать в любом случае из выражения Холдейна (4 45), а применимость этого выражения не ограничивается системами, в которых Км и V имеют такое простое значение. Из уравнения (4.45) после логарифмирования и дифференцирования (по температуре) получаем

dig У, dlg Хм? dlgVb d|g 7(м7_ dlg/C .

или после умножения на 2,303 RT2

('AH*2f• +RrAHif') - ('ДЯV r + iAnТак как величины RT сокращаются, мы получаем уравнение, идентичное по форме последнему уравнению в примечании к табл. 4.11 Символами в кавычках обозначены в уравнении (4.301) величины, полученные графически на основе экспериментальных данных обычным путем Если бы первоначальные

Кинетика действия ферментов Таблица 4 12

Термодинамические характеристики фумаратгидратазы при рН б.Зб1'

Температура АнхЪ ДЯ/, расч АН

Ниже 18°С Выше 18 °С 400 4200 10 000 6 100 — 1200 — 1200 15 000 15 000 —3400 —3500 —3600 -3600

д^1/ AOib Д(4 AGf, расч AGj

Немного ниже 18 °С Немного выше 18°С —3600 —3600 12 900 12 900 —2800 —2800 13 600 13 600 — 1500 —1500 —865 —865

ASlf AS2f ASlb Д52Ь ASf, Расч

Немного ниже 18°С Немного выше 18°С 13,7 26,8 — 10 —23,4 7,1 7,1 4,8 4,8 —8,2 —8,5 —9,4 —9,4

11 Прн сопоставлении величин ДЯ с данными, приведенными на рис. 4.63 и 4 64, по которым они были найдены, следует помнить, что Д#* = Я—RT [уравнение (4 296)]. Индекс / относится к гидратации фумарата, индекс Ь — к дегидратации малата.

допущения были справедливы, то кавычки можно было бы опустить; однако уравнение остается справедливым также и в том случае, если эти величины являются сложными функциями.

Хотя расчеты изменений энтропии, связанных с различными стадиями ферментативной реакции, являются относительно несложными, интерпретация значений полученных данных — весьма трудная проблема. Ее детально рассматривал Лайдлер [2682]; иллюстрацией может служить рассмотрение данных об изменении энтропии при образовании фермент-субстратного комплекса Для простой реакции E + S = ES можно ожидать, что образование комплекса сопровождается понижением энтропии; действительно, имеются сообщения о том, что на первой стадии действия химотрипсина [4367], карбоксипептидазы [2894] и уреазы [4965] энтропия уменьшается. Однако факторы, вносящие вклад в изменение энтропии при связывании субстрата, более сложны, чем можно было бы предполагать, рассматривая простое уравнение связывания, показано, что у ряда ферментов, в том числе у пепсина [702], трипсина [644] и фумаратгидратазы (табл 4 12), этот процесс характеризует-

17—2277 Глава 4

ся положительным изменением энтропии. Один из факторов, который, очевидно, вносит вклад в наблюдаемое изменение энтропии, — это изменение конформации фер'Мента (гл. 6). Кон-формационные изменения могут приводить либо к разрыхлению, либо к компактизации структуры фермента и, таким образом, сопровождаются либо увеличением, либо уменьшением энтропии. Второй фактор, который может влиять на энтропию процесса, — это изменение связывания растворителя. В любой бимолекулярной реакции всегда происходят изменения энтропии, обусловленные «антисмешиванием», т. е. потерей молекул растворителя при образовании активированного комплекса;, этот эффект, однако, весьма невелик (—7,9 энтропийных единиц в водном растворе). Кроме того, изменения полярности фермента в результате образования комплекса с субстратом могут привести либо к связыванию, либо к освобождению молекул воды. Например, если связывание субстрата приводит к нейтрализации заряда, то это ведет к освобождению молекул воды и увеличению энтропии, если же связывание субстрата вызывает увеличение заряда, то возрастает связывание молекул воды, что характеризуется понижением энтропии. Рассмотренные выше эффекты относятся к изменениям энтропии, происходящим не только на стадии связывания субстрата, но и на других стадиях реакции.

я

3бООкал

1200кал

ЕМ

Рис. 4.66. Изменение Н для реакции, катализируемой фумаратгидратазой в

кислом растворе [ЗОН].

Кинетика действия ферментов Влияние температуры на состояние ионизации фермента

В разделе, посвященном рН, мы обсуждали влияние изменений в состоянии ионизации различных групп на величину сродства фермента к реагирующим веществам и на скорость •ферментативной реакции. Изменения температуры будут в свою очередь вызывать изменения в состоянии ионизации каждой из рассматриваемых групп, и размер этих изменений определяется теплотой ионизации соответствующей группы. Влия-яие температуры на Км и V отчасти определяется изменением рН-функций компонентов, в результате которого изменяется характер кривых рН—активность.

Если построить график зависимости рКм от рН, подобный тем, какие изображены на рис. 4.51—4.56, то положение перегибов на кривых позволит определить величины рК ионизирующихся групп, участвующих в связывании фермента с субстратом. Таким образом, строя кривые для ряда значений температуры, можно по смещению положения точек перегиба определить изменения рК с изменением температуры. Отсюда теплота ионизации соответствующей группы может быть рассчитана по уравнению

АН = —2,303 • RT2 (4.302)

Нам в настоящее время не известны такого рода исследования. Видимо, данная область пока еще совершенно не разработана, и только в одном случае подобные определения были выполнены для ингибитора, при действии тиоцианата на фумарат-гидратазу (3018].

Строя график зависимости lg V от рН, часто можно определить величины рК ионизирующихся групп, которые влияют на распад комплекса ES. Правда, вследствие наложения перегибов такая интерпретация кривых рН—активность при помощи величины рК не всегда оказывается легкой (см. раздел о влиянии рН). Однако в тех случаях, когда рК удается определить, теплоты ионизации соответствующих групп могут быть рассчитаны по величине рК при различных значениях температуры. Это было сделано для трипсина Гутфрейндом [1719], который по величине рК и рассчитанной теплоте ионизации заключил, что ионизирующейся группой оказывается в этом случае остаток гистидина.

Д. ВЛИЯНИЕ ДАВЛЕНИЯ

Лайдлер [2685] отметил, что важную информацию о катализируемых ферментами реакциях можно получить, исследуя

17* Глава 4

влияние гидростатического давления. Поскольку повышение давления способствует протеканию процессов, идущих с уменьшением объема системы (и наоборот), можно определять изменение объема для каждой стадии реакции, подобно тому, как определяют изменение АН при изменении температуры. Давления, необходимые для проведения таких исследований, весьма велики (10 000—100 000 фунтов на квадратный дюйм), и не исключено, что третичная или четвертичная структура исследуемого фермента может при этом измениться. К сожалению, данный подход использовался лишь в очень немногих исследованиях, а анализ результатов не был столь полным, как, например, в рассмотренном выше случае влияния температуры на фумаратгидратазную реакцию. Ряд ферментных систем был исследован при таких концентрациях субстрата, когда скорость реакции, вероятно, равна V, а также при очень низких концентрациях субстрата, когда скорость пропорциональна V/Км- Эти данные суммированы Лайдлером и Бантингом [2686], в их работе приведены такж

страница 57
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Ферменты. Том 1" (3.77Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(20.11.2018)