Биологический каталог




Ферменты. Том 1

Автор М.Диксон, Э.Уэбб

ан, кал/моль

Карбоксильная (а) 3,0—3,2 (±1500)

Карбоксильная (в аспарагиновой кислоте) 3,0—4,7 (±1500)

Карбоксильная (в глутаминовой кислоте) 4,4 (±1500)

Фенольный гидроксил (в тирозине) 9,8—10,4 6000

Сульфгидрильная [356] 8,3—8,6 —

Имидазольная (в гистидине) 5,6—7,0 6 900—7 500

Аминогруппа (а) 7,6—8,4 10 000—13 000

Аминогруппа (а, в цистине) 6,5—8,5 —

Аминогруппа (е в лизине) 9,4—10,6 10 000—12 000

Гуанидиновая (в аргинине) 11,6—12,6 12 000—13 000

способствовать разделению зарядов и, следовательно, рК уменьшится. Если же в результате реакции суммарный заряд не изменяется, как, например, при диссоциации аминогруппы R— —NH+3^:R—NH2 + H+, то при изменении диэлектрической постоянной рК, скорее всего, изменится незначительно. Такой подход был использован Рабином и др., показавшими, что обе ионизирующиеся группы, которые выявляются при исследовании рН-зависимости активности рибонуклеазы [1340], являются катионными и находятся в кислой форме.

Следует отметить, что точки перегиба на кривых рН—lg V и рН—рКм характеризуют величины молекулярных констант ионизации (Ки Кч и т. д.), а не констант ионизации групп (Кх, Ку и т. д.). Это можно показать следующим образом. Если в уравнении (4.249) f~x является рН-функцией активной формы фермента и может быть представлена кривой, сходной с той, которая изображена на рис. 4.47, то уравнение для средней (независимой от рН) части графика будет иметь вид pf~x = =—lg(l + KiylKix), уравнение для левой части pf~x = = —lg(H/Kix) и уравнение для правой части р/~* =—lgfA^/H). При пересечении в левой части графика первые два выражения должны быть равны и поэтому H = Kix + Kiy = Ki [см. уравнение (4.245)]. Аналогично при пересечении в правой части графика должны быть равны первое и третье выражения и поэтому Н = U(UK2x+lfKay)=K2 по уравнению (4.244).

Если константы значительно отличаются друг от друга, то определенные по графику молекулярные константы будут рав-

Кинетика действия ферментов ны константам ионизации групп. Только в том случае, когда константы мало отличаются друг от друга, необходимо проводить различие между молекулярными константами и константами ионизации групп, но при этом трудно точно вычислить рК\ и р/Сг. Если все же такие вычисления удалось сделать, нельзя безоговорочно утверждать, что эти константы являются именно константами ионизации определенных групп.

Наконец, следует отметить, что идентификацию специфической ионизирующейся группы описанным выше способом не следует рассматривать как доказательство участия соответствующей группы в формировании активного центра. Так, при наличии зависимых от рН обратимых конформационных изменений фермента, приводящих к потере активности, могут получаться результаты, трудно отличимые от тех, которые обусловлены ионизацией группы активного центра (если не проведено исследования влияния рН на конформацию фермента). Для хи-мотрипсина убедительно показано, что р/С~8,5, определенное из графика lg V—рН, связано именно с такими конформацион-ными изменениями (см. [1933]).

Критический анализ проблемы интерпретации влияния рН на активность ферментов был проведен Ноулзом [2498].

Г. ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ

Длщшяе температуры на скорость ферментативных реакций может быть обусловлено действием ряда различных факторов. Температура влияет на стабильность фермента; на скорость распада фермент-субстратного комплекса (т. е. на &+г), определяемую по величине теплоты активации реакции; на сродство фермента к субстрату (т. е. на k+l и k-\); на величину рН-функций одного или всех компонентов (в результате изменения рК, определяемых по теплоте ионизации); на сродство фермента к активаторам или ингибиторам (если таковые имеются); на природу ключевой реакции (если в системе участвуют несколько ферментов с различными температурными коэффициентами) и даже на такие факторы, как изменение концентрации растворенного 02 вследствие изменения растворимости (в манометрических опытах) или рН используемого буферного раствора.

Многообразие форм, в которых проявляется влияние температуры на скорость ферментативных реакций, дает основание ожидать, что анализ этого влияния должен представлять большие трудности. В действительности, однако, влияние температуры легко исследовать экспериментально. Влияние на стабильность фермента можно изучить, инкубируя фермент при различных значениях температуры в течение определенного периода времени, а затем определяя его активность в той температурной зоне, в которой он остается стабильным. Влияние Глава 4

температуры на сродство фермента к субстрату или активатору можно элиминировать использованием достаточно высоких концентраций субстрата или активатора, при которых фермент оказывается насыщенным, что дает возможность определить влияние температуры на V. Влияние на константу Михаэлиса можно изучить с помощью обычных методов, в некоторых случаях можно даже определить влияние температуры на каждую из трех констант скорости. Влияние на рК каждого из компонентов реакции определяется с помощью методов, описанных в последнем разделе этой главы. В полиферментных системах каждый фермент обычно можно изучать в отдельности, чтобы таким образом избежать лимитирующих влияний на скорость наблюдаемого процесса со стороны других ферментов. Наконец, влияние температуры на большую часть прочих^факторов можно, как правило, исключить, если достаточно тщательно следить за всеми деталями методики проведения опытов.

Теплота инактивации ферментов

Если построить серию кривых, отражающих ход ферментативной реакции при различных значениях температуры, то эти кривые будут в общем случае близки к тем, которые изображены на рис. 4.57. Хотя истинная начальная скорость реакции неуклонно увеличивается по мере повышения температуры," количество субстрата, подвергшегося превращению за определенный промежуток^ времени, вначале повышается, а затем падает, вследствие чего наблюдается кажущийся температурный оптимум. Эта наблюдаемая оптимальная температура не остается постоянной, она падает по мере увеличения промежутка времени, в течение которого рассматривается процесс^ что видно, например, из сравнения t\ и t2 на рис. 4.57. <.

В данном случае одновременно действуют два различных фактора, определяющих влияние температуры: с одной стороны—увеличение начальной скорости (или истинной каталитической активности фермента), с другой — деструкция фермента при более высоких значениях температуры, обусловливающая непрерывное уменьшение концентрации активного фермента. Все это проявляется в увеличении кривизны приведенных на рис. 4.57 кривых при повышении температуры. Оптимальная температура зависит от соотношения между влиянием температуры на скорость ферментативной реакции и ее влиянием на скорость деструкции фермента, так что наблюдаемые величины температурных оптимумов, в сущности, не имеют особого значения.

Скорость инактивации ферментов в растворе быстро возрастает с повышением температуры; почти во всех случаях инактивация происходит практически мгновенно при значениях

Кинетика действия ферментов Рис. 4.57. Типичные кривые хода ¦ферментативной реакции при различных значениях температуры, показывающие, зависимость кажущегося температурного оптимума от времени наблюдения.

температуры, близких к 100 °С, в большинстве же случаев она наступает при температуре около 70°С. Число ферментов, которые устойчивы при температуре 100°С, исключительно мало; классическим примером может служить аденилаткиназа (КФ 2.7.4.3), выдерживающая в течение продолжительного времени температуру 100 °С при рН 1. Интересно, однако, что некоторые бактерии, обычно живущие в^условиях высоких температур (так называемые термофильные бактерии), содержат ферменты, отличающиеся необычно высокой термостабильностью. Показано, например, что кристаллическая а-амилаза (КФ 3.2.1.1), выделенная из Bacillus stearothermophilus, сохраняет 90% своей активности после инкубации при 90 °С в течение 1 ч |[2965].

Тепловая инактивация ферментов почти всегда является результатом денатурации белка. Температурный коэффициент процесса инактивации значительно выше, чем у какого-либо другого известного процесса, за исключением денатурации белков* величина этого коэффициента может, однако, сильно варьировать— от 10 до нескольких сотен. Строгая пропорциональная зависимость между инактивацией фермента и денатурацией белка была продемонстрирована для пепсина А (КФ 3.4.23.1) и трипсина (КФ 3.4 21.4) Нортропом [3470, 3472]; результаты одного из опытов такого рода представлены на рис. 4.58. В тех случаях, когда при определенных условиях денатурация белка могла быть обращена, параллельно с ренатурацией белка наблюдалось и восстановление активности фермента.

Имеется ряд детальных исследований по термодинамике тепловой денатурации белков [531, 2893, 3706, 4663]; они, однако, относятся к области белковой химии и не будут подробно рассматриваться в этой книге. Измерение ферментативной акГлава 4

5,6 6,0 6,4

страница 52
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Ферменты. Том 1" (3.77Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(20.11.2018)