Биологический каталог




Ферменты. Том 1

Автор М.Диксон, Э.Уэбб

мплекса ES (увеличение наклона) значение 4,5, а для рК свободного фермента (или субстрата) два значения: 5,3 и 7,9. рК комплекса ES можно определить также по кривой рН—lg У, но не но кривой рН—Igfo; в то же время рК фермента определяется по кривой рН—lguo. но не по кривой рН—lg У в полном соответствии с приведенной выше теорией. Рис. 4.51 иллюстрирует уже упоминавшийся выше факт, а именно, что рК, характеризующее такую группу фермента, которая может влиять на скорость реакции, и выявляющееся на кривой рН—lg У, не обнаруживается при построении кривой для рКм, если константа ионизации данной группы не изменяется в результате присоединения субстрата.

Кинетика действия ферментов Ряд интересных результатов, полученных Доджсоном и др. [ИЗО] в опытах с арилсульфатазой (КФ 3.1.6.1) и тремя различными субстратами, показан на рис. 4.55. Можно отметить, что данный фермент характеризуется двумя р/С, имеющими значение около 8,1 и 9,4, а комплекс ES — одним р/С, слегка изменяющимся при использовании различных субстратов (в пределач 7,5—7,8). Один из субстратов содержит дополнительную фенольную группу, которая характеризуется (по кривой титрования свободного субстрата) величиной р/С около 6,5. Это обстоятельство вызывает появление дополнительной волны на кривой, при этом видны два новых значения р/С — одно несколько больше 6,5, принадлежащее свободному ферменту или субстрату, и другое 6,9, принадлежащее ES-комплексу. р/С 6,5 соответствует р/С свободного субстрата; оно не может принадлежать ферменту, так как не обнаруживается на других кривых; р/С 6,9, очевидно, относится к ионизации той же самой группы в субстрате, соединившемся с ферментом, и указывает на то, что эта группа в комплексе ES все еще свободна, хотя соединение субстрата с активным центром фермента делает ее менее кислой. Возможно, изучение подобного влияния соединения с ферментом на различные функциональные группы субстрата позволит составить представление о характере электронных изменений, которые происходят в молекуле субстрата, когда она активируется в результате взаимодействия с ферментом.

Тщательное исследование влияния рН на активность карни-тин-ацетилтрансферазы (КФ 2.3.1.7) провел Чейз [747]; результаты его представлены на рис. 4.56. Фермент катализирует реакцию

Приведенные данные получены при исследовании реакции в обоих направлениях. График на рис. 4.56,Л указывает на рК около 7,1; поскольку, однако, «и карнитин, ни ацетилкарнитин

Рис. 4.55. Зависимость Кл от рН при действии арилсульфатазы (КФ 3.1.6.1) [ИЗО]. / — субстратом служит нитрокатехолсульфат; // — субстратом служит /г-нитрофенилсульфат; /// — субстратом служит /г-ацетилфенилсульфат.

Карнитин + Ацетил-СоА = Ацетилкарнитин -f - СоА.

Рн Глава 4

6 7 8 рН 9

4.5

5 К Р-

3.5

2,5 1 \ 1

рН

Рис. 4.56. Зависимость р/(м от рН для реактантов карнитин-ацетилтрансфераз-ной (КФ 2.3.1.7) реакции [747]: для карнитииа (А, кривая /); для ацетилкар-нитина (А, кривая //); для СоА (Б, кривая /); для ацетил-СоА (Б, кривая //) и для ацетил-З'-дефосфо-СоА {Б, кривая Ш).

не ионизируются в исследованной области рН, это значение должно относиться к рК группы свободного фермента. Результаты, полученные с СоА и его производными (рис. 4.56,5), интерпретировать трудно; соответствующие графики для СоА и ацетил-СоА дают рК 8,25, которое характеризует ионизацию фермент-субстратного комплекса, а также рК 6,4 и 7,85, характеризующие ионизацию либо свободного фермента, либо субстрата. Так как СоА и его производные содержат фосфатную группу с рК около 6,4, то обнаруженное значение рК могло бы соответствовать ионизации фосфатных групп этих соединений, находящихся в свободном состоянии. О том, что это действительно так, свидетельствуют результаты, полученные при использовании аналога, ацетил-дефосфо-СоА, который не имеет такой группы (рис. 4.56, Б, кривая ///). На основании исследования рН-зависимости реакции, катализируемой химотрипси-ном (КФ 3.4.21.1), Фёршт и др. [1307, 1327] высказали предположение о том, что в двух случаях рК, определяемые в подобных исследованиях, не равны истинным значениям рК участвующих в процессе групп.

Кинетика действия ферментов 1. Изменение лимитирующей стадии при изменении рН. Для реакции типа

Е" ^ E"S ^ E"S -> Е" + Р к

xs,

(4.277)

E"fl ^±F"+,S ^ E"T'S' — E" + l +Р

зависимости Км и У от рН аналогичны рассмотренным выше (см. [2328]). Если, однако, &'+2 и &'_2 очень малы, система становится асимметричной, и зависимости рН—V и рН—Ки оказываются невзаимосвязанными:

Е ^ E"S ^ E°S' -E"+'^E"+,S E""S

(4.278)

Если в системе (4.278) &_2 больше й+з, то лимитирующей стадией при высоких значениях рН будет распад комплекса E"S'. Однако при уменьшении рН концентрация E"S/ будет падать, и в связи с этим скорость на &2-стадии уменьшится, а на стадии с образованием комплекса E^+'S' увеличится. Таким образом, при низких и высоких рН имеют место следующие реакционные последовательности: при высоких рН

k k E«S » E»S' -X, (4.279)

-2

где &+3[E"S']<&_2[E"S'], так что &+3-стадия является лимитирующей; при низких рН

E"S ¦?—f E"S'

к _

Быстро

(4.280)

E"+iS' ->

Рассматриваемый эффект вносит некоторую неопределенность при трактовке рК, полученной по графику зависимости рН—V. На с. 220 уже отмечалось, что при изменении рН может измениться лимитирующая стадия. Кинетика ряда систем такого Глава 4

типа была детально рассмотрена, например, в работе [565а]. Анализ системы

Е"-1

ft+l Ket =fc E"-XS ==

E"S

+2

E" + P

(4.281)

в стационарном приближении приводит к следующему уравнению скорости:

0 =

(4.282)

При низких рН лимитирующей оказывается A+i-стадия, а при высоких — &+2-стадия. В результате величина р/С в выражении для Км не является истинной, поскольку она частично определяется кинетическими константами.

2. Образование непродуктивного комплекса: Фастрез и Фёршт [1307] отметили, что в том случае, когда субстрат образует с ферментом тупиковый комплекс, графики зависимости V и Км от рН могут давать кажущееся р/С, отличающееся от реального значения, свойственного продуктивному комплексу, если доля тупикового комплекса изменяется с изменением рН. Для системы

kt2

МеЬленио К

e"s ^± e"s'

К ,

(4.283)

в которой распад комплекса E"S протекает столь медленно, что остальные компоненты системы остаются в равновесии, уравнение скорости имеет вид

_ *+2в_

1 +

v = -

н (

1 + т1Ь)

KsS

i +

(4.284)

Из этого уравнения следует, что р/С, определяемое по графикам зависимости р/См или lg V от рН, отличается от истинной величины:

Р^наблюдаемое^Р^ 1 -J-/C'

(4.285)

Кинетика действия ферментов Другие случаи непродуктивного связывания обсуждались Уор-тоном и др. [5060].

Хотя два рассмотренных выше случая и могут иметь место, следует подчеркнуть, что, как правило, определяемые значения р/С являются истинными р/С функциональных групп на поверхности фермента и, следовательно, помогают установить химическую природу этих групп. Надо, конечно, учитывать при этом, что совпадение р/С, определенной по графику, с р/С известной химической группы еще не является достаточным основанием для однозначной идентификации, поскольку сходные значения р/С могут иметь разные группы. Кроме того, данная функциональная группа в молекуле фермента может иметь р/С, отличающееся от того, которое характерно для нее в свободной аминокислоте или другой небольшой молекуле, поскольку в свернутой определенным образом молекуле фермента на р/С данной группы влияют соседние функциональные группы. Изменение р/С, однако, обычно относительно невелико и редко превышает две единицы рН [827, с. 445].

Идентификации исследуемой группы может помочь определение влияния температуры на ее р/С, позволяющее рассчитать теплоту ионизации (АЯ) группы. Для реакции ионизации

НЕ =5^ Н+ + Е- (4.286)

можно записать

AH=2,303RT2-^Ka_, (4.287)

или

Д#=-2,303ЯТ2 *- = 2,303tf -щщ-.

Таким образом, график зависимости р/С от 1/7" является прямой с наклоном —АЯ/2,303#

В табл. 4.10, заимствованной у Эдсалла [827], приведены р/С для ряда групп, присутствующих в белках, а также значения энтальпии (АЯ) ионизации этих групп Изменение окружения группы, входящей в состав белка, может изменять не только ее р/С, но также и АЯ ионизации; поэтому при идентификации специфических групп по результатам измерения ДЯ следует учитывать те же ограничения, что и при использований для этой цели р/С.

Интерпретации результатов определения р/С помогают в ряде случаев исследования по влиянию изменения диэлектрической постоянной среды на р/С. Если в результате диссоциации группы происходит увеличение суммарного заряда, как, например, при диссоциации карбоксильной группы R—COOH^R— —СОО-+Н+, то увеличение диэлектрической постоянной будет Глава 4

Таблица 4.10

Значения рК и теплоты ионизации некоторых групп, присутствующих в белках

Группа р/С (25 °С)

страница 51
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Ферменты. Том 1" (3.77Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(16.11.2018)