Биологический каталог




Ферменты. Том 1

Автор М.Диксон, Э.Уэбб

ретацию действия ингибиторов.

Если ионизирующиеся группы не участвуют в образовании связи между ферментом и субстратом, то они обычно могут ионизироваться и в комплексе; однако в результате образования комплекса может иметь место изменение величин р/С, что сопровождается появлением на графике волнообразного сдвига, как показано на кривых // и /// рис. 4.53 Если масштаб вертикальной и горизонтальной шкал на графике один и тот же, что весьма желательно, то разность между уровнями (по вертикали) в результате появления волны равна изменению величины р/С при образовании комплекса. Если же ионизирующаяся группа непосредственно вовлекается в образование связи, то ионизация ее обычно полностью подавляется, на графике это

¦ выражается появлением перегиба (рис. 4.53, кривая /).

Ионизация групп, которые одинаково сильно ионизируются и в свободном ферменте, и в фермент-субстратном комплексе, практически не оказывает влияния на Ks, хотя ионизация этих групп может влиять на V и проявляться на кривой рН — lg V; это весьма благоприятное обстоятельство, так как оно означает, что только те ионизирующиеся группы, которые тесно связаны с активным центром фермента, т. е. группы, изменяющие характер ионизации в результате соединения с субстратом, обнаруживаются на графиках рН — рКш- Многие ионизирующиеся группы в ферменте, более удаленные от активного центра, не обнаруживают себя на этих графиках. Необходимо, однако,

• отдавать себе отчет и в том, что некоторые группы, не ионизи-

Кинетика действия ферментов Рис. 4 53. Схема, иллюстрирующая возможные влияния рН на Лм; объяснение см. в тексте.

рующиеся вообще, могут быть ответственны за соединение с субстратом или вовлекаться в это соединение, хотя график не даст нам никаких указаний на существование этих групп.

б. СТАЦИОНАРНЫЕ УСЛОВИЯ

Изложенная выше теория применима при рассмотрении влияния рН на Ks- Естественно возникает вопрос: можно ли пользоваться этой теорией и при анализе влияния рН на Км в условиях, рассмотренных Бриггсом и Холдейном, т. е. когда Км не является истинной константой равновесия, а определяется выражением (k-i + k+2)/k+1, в котором какая-либо из констант или даже все три константы скорости могут изменяться при изменении рН? Анализ этого вопроса упрощается, если принять во внимание, что реакция, характеризующаяся константой скорости k+i (образование комплекса из свободного фермента и субстрата), зависит только от состояния ионизации фермента и субстрата и не зависит от состояния ионизации комплекса, тогда как реакции с константами скорости k-\ и k+2 (реакции распада комплекса либо на фермент и субстрат, либо на фермент и продукт) зависят только от ионизации комплекса и не зависят от ионизации фермента и субстрата.

В предыдущем разделе уже было отмечено [уравнение (4.255)], что влияние рН на k+2 учитывается при подстановке k+2/f~es вместо k+2, при этом константа скорости и выбранная функция рН относятся к распадающейся форме комплекса ES. Допуская, что та же самая форма комплекса ES участвует в реакции, характеризующейся константой скорости k-u как это показано для системы (4 257), можно вместо k-\ подставить k~\lf~es- Для /г+греакции, в которой участвуют как свободный 15-2277 Глава 4

фермент, так и субстрат, вместо k+1 можно написать k+i/(f~efs)-Если произвести эти подстановки, то мы получим

/См= k-* + k+* (4.274>

"+1 k+i I es

Таким образом, влияние рН на /См оказывается точно таким же, как и влияние рН на Ks [см. уравнение (4.267)], так как k+i, k-i и k+2 не зависят от рН, ибо они относятся к определенным ионным формам компонентов. Поэтому теория о влиянии рН на Ks применима и к данному случаю.

Выражение такого вида было впервые выведено для кинетики стационарного состояния по Бриггсу — Холдейну Валеем [4946]. Полное выражение для скорости реакции в системе (4.257) может быть представлено следующим образом (включая выражение Валея для V):

_k+g_

1 +

н , Kes2

Kesl 1 н

Н К Si \

Кп 4 - н /

v==---ii—-. (4.275)

*=1 + \ JL Kei + Н Н + _Н» I

н

1+ Kesi + Н

1 + S ¦ Г . ¦ ~ - . . Н . Ке

В данном случае сделаны допущения, что активной формой комплекса является ES", что эта форма образуется в результате соединения Е" с S и что субстрат может подвергаться ионизации как двухосновная кислота.

При анализе зависимости Ks °т рН в равновесных условиях было отмечено, что вопрос о том, какие именно ионные формы компонентов соединяются при образовании комплекса ES, не имеет значения. Для величины Км это положение перестает быть справедливым. Если в системе (4.257) E"~' также соединяется с S, в результате чего образуется ES"-1, то скорость этой реакции следует добавить к скорости реакции с константой k+u что отразится на результате. Лайдлер [2683], развивая анализ Боттса и Моралеса [501], вывел полные кинетические уравнения для такой системы и показал, что если образование активной формы комплекса ES из Е" происходит значительно быстрее, чем ее образование из какой-либо другой формы фермента, то приведенные выше уравнения будут справедливы; если же это условие не соблюдается, то могут иметь место ошибки в величинах ионизации (р/С) до 0,3 единицы рН. Поскольку, однако, такие ошибки лежат, по-видимому, в пределах ошибок опыта для работ подобного рода, это ограничение не является существенным.

Кинетика действия ферментов Лайдлер и другие исследователи [68, 2328, 2613, 2683, 3572, 3643] рассмотрели также более сложные случаи, при которых все три ионные формы свободного фермента В (4.257) могут связывать субстрат с образованием комплексов, способных распадаться с образованием продуктов. Уравнения для таких си-•стем в предположении стационарности являются слишком сложными, если только не принять допущение, согласно которому процессы ионизации протекают достаточно быстро по •сравнению с процессами образования и распада комплексов. Лайдлер показал, что в таких условиях рН-теория вполне применима и что получаемые кинетические уравнения позволяют объяснить поведение ряда ферментов.

В анализе Лайдлера и других подразумевается, что влия-шие рН на k-\- и &+2-реакции сходно, так как обе эти реакции зависят от состояния Е. Можно, однако, допустить, что не во всех случаях это так, хотя нелегко сформулировать условия, при которых влияние рН на указанные реакции было бы различным. Если существует еще некое дополнительное влияние рН только на k+2, то эту константу следует умножить на некоторую рН-функцию, например на /+2. При этом все остальные константы останутся неизменными и уравнение (4.274) надо >будет заменить уравнением ^

К _ k-l ~Ь/+2^+2 fe fs

k+l tl es л

Насколько сильно данное обстоятельство будет влиять на результаты анализа, зависит от относительных величин k-\ и k+2, а также от природы f+2. Мы не располагаем данными, которые указывали бы, что рассмотренное осложнение имеет место, но такая возможность не может быть полностью исключена. По мнению Лайдлера, если пренебречь возможностью небольших «ошибок в величинах констант ионизации, о которых упоминалось выше, то теорию влияния рН на образование комплекса Е можно считать применимой не только к случаям равновесия, но также к случаям стационарного состояния, предусмотренного теорией Бриггса — Холдейна. Таким образом, как при равновесном, так и при стационарном связывании субстрата может быть применена общая рН-теория и соответствующие величины рК можно определить по графику зависимости рКм от рН. Использование же графиков зависимости lg V и lg V/Км от рН позволяет получить лишь небольшую дополнительную информацию, поскольку

BtfM = lg-Jl--lg V- (4.276)

•Однако, как отмечалось выше, график зависимости lg V—рН позволяет выявить ионизирующиеся группы, рК которых не из-

15* Глава 4 4

Рис. 4.54. Зависимость Км от рН 8 Ю

при действии щелочной фосфатазы (КФ 3.1.3.1). По Мортону [3271], проанализировано М. Диксоном [1109].

меняется при связывании субстрата (с. 217). Кроме того, поскольку зависимости рКм—рН бывают в ряде случаев довольно сложными, использование двух других графиков является весьма полезным подходом для проверки полученных значений. На графиках зависимости lg У и lg У/Км от рН наблюдается только уменьшение наклонов; вклады этих графиков видны на графике рКм — рН. Поскольку стадиям ионизации комплекса ES соответствует на графике рКм — рН увеличение наклонов, на графике lg У—рН им отвечает уменьшение наклонов, а на графике lg У/Км—рН эти стадии не выявляются. В то же время стадиям ионизации свободного фермента (или субстрата) соответствует уменьшение наклонов как на графике рКм—рН, так и на графике lg У/Км—рН, а на графике lg У—рН эти стадии не выявляются.

Выполнен ряд детальных исследований по выяснению влияния рН на активность отдельных ферментов. М. Диксон рассмотрел шесть случаев, из которых три представлены на рис. 4.51, 52 и 54. Применение изложенных выше правил для интерпретации кривых иллюстрирует рис. 4.52; рКм-кривая дает для рК ко

страница 50
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Ферменты. Том 1" (3.77Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(10.12.2018)