Биологический каталог




Ферменты. Том 1

Автор М.Диксон, Э.Уэбб

подставить выражения для К\ и Кг (4.245) и (4.246).

Возможность использования рассмотренных выше рН-функ-ций не зависит от химической природы ионизирующихся групп; их применимость не ограничивается молекулами с двумя карбоксильными группами, но в равной мере распространяется также на амфолиты, такие, как аминокислоты, и на активные центры ферментов, для которых природа ионизирующихся групп может быть неизвестна. График функции l/f~x может, например, очень хорошо отражать влияние рН на количество активной формы фермента и таким образом соответствовать графику зависимости активности от рН. Это может относиться также к графику функции l/f~y, поскольку активная форма — это не обязательно та форма, доля которой наибольшая, и графики не указывают, какая из промежуточных форм является активной. Количества преобладающей и второстепенной форм изменяются в зависимости от рН аналогичным образом, и активная форма может присутствовать лишь в относительно очень малом количестве.

Из определений (4.243) видно, что отношение концентраций двух промежуточных форм равно

[АН»"] _ К,

[АН/] га К\

IX

(4.252)

Кинетика действия ферментов и не зависит от рН. Другими словами, [АН-*] и [АН~У] [а следовательно, также и их сумма [АН-], определяемая по уравнению (4.228) через Ki и Кг] одинаковым образом зависят от рН. Следовательно, все, что можно получить при титровании вещества или при исследовании характера зависимости активности от рН, — это величины молекулярных констант Ki и Кг-Подобные исследования не позволяют непосредственно определить отношение [АН-*]/[АН-у]. Значения, обратные значениям четырех рН-функций (которые определяют доли всего количества вещества, присутствующие в соответствующих четырех формах), отложены по оси ординат на графике рис. 4.48, который иллюстрирует влияние изменений рК\у- К\% и Кгу приняты равными 10-7 и 10-8 М соответственно, но для рис. 4.48, Л К\у~К\х, а для рис. 4.48,5 она равна Кгу- В случае, изображенном на рис. 4.48, Л, речь может идти о молекуле с двумя сходными группами, между которыми существует некоторое взаимодействие; в случае, изображенном на рис. 4.48,5, — о молекуле с двумя разными не взаимодействующими группами. Кривые для обеих промежуточных форм расположены в одной и той же области рН, имеют, как и прежде, максимумы при рН0 и характеризуются той же формой, что и рассмотренная выше кривая для Если все константы ионизации групп

равны между собой и если рН = рК, то каждый из четырех членов в каждой из четырех рН-функций становится равным единице и каждая ионная форма будет составлять 'Д общего количества данного вещества. В этом случае общее количество

1.0

3 4 Б

S 7 РН

9 10 II 12

Рис. 4.48. Изменение величин, обратных рН-функциям, в зависимости от рН для несимметричной системы с указанными значениями

0,5

О

ли,

3 4 5 6 7 8 3 10 U 12 рН Глава 4

промежуточной формы будет составлять 1/2 общего количества вещества, а не 7з> как прежде (когда К\ принималась равной Кг).

Если использовать символ х для более сильно ионизирующейся группы, то тогда величина Kiy будет лежать между Kix и Кгу', она не может быть меньше Кгу, ибо в результате ионизации одной группы ионизация другой будет уменьшаться, а не увеличиваться

Из уравнений (4 245), (4 246) можно получить, что

_^=^(2+-/^+4!И (X. Диксон и Типтон[П05]. (4.253)

А2 l\2x \ "чу i\2y )

Следовательно, Ki будет больше, чем 4Кг, если только не имеет место довольно редкая ситуация, при которой Кгх>К\х, т. е. протонирование одной группы увеличивает способность другой группы связывать протон Такая положительная кооператив-ность при связывании протона может происходить, если, во-первых, при протонировании одной группы вытесняется поливалентный катион (в результате протонирование уменьшает положительный заряд молекулы) или, во-вторых, происходит протон-зависимое изменение конформации молекулы

На рис. 4.49 приведено семейство кривых, соответствующих функции \lf~x; они иллюстрируют влияние изменения рКгу при постоянном pKix на количество одной из промежуточных форм (например, активной формы фермента; в этом случае ордината может отражать скорость ферментативной реакции) Это очень напоминает влияние некоторых ингибиторов на рН-зависимость ферментов (см, например, [3313], рис. 1). Олберти и Массей [70] приводят подобное семейство кривых, но используя константы Ki и Кг-

ч 5 6 7 8 3 10 U 12 РН

Рис 4.49. Зависимость количества одной из промежуточных форм, АН»-, от рН при изменении рКм и постоянных рЛи и рКщ- рКи постоянно и равно 6; рК\у равно 7,5; значения pfoff приведены рядом с кривыми. Кривые построены

по уравнению (4.249).

Кинетика действия ферментов Так как мы рассматриваем изменение активности ферментов под влиянием факторов, оказывающих действие на определенные группы ферментов, а не результаты титрования, то мы полагаем, что в этом случае лучше пользоваться константами ионизации групп. Графики рН-функций, показывающие влияние одновременного изменения обеих констант ионизацил ам-фолита, были рассмотрены значительно раньше Михаэлисом [3147].

В последующих разделах в тех случаях, когда функции обозначены просто через / и т. д, подразумевается, что используются соответствующие выражения для этих функций.

Влияние рН на V

Как уже упоминалось, влияние рН только на V можно определить путем проведения серии измерений скорости ферментативной реакции при различных значениях рН в условиях, когда концентрация субстрата достаточно высока для постоянного насыщения фермента. Таким образом исключается какое-либо влияние рН на сродство фермента к субстрату. В этих условиях весь фермент находится в составе комплекса ES, и так как скорость ферментативной реакции является в конечном счете скоростью распада комплекса на свободный фермент и продукт, то влияние рН на V определяется только состоянием ионизации комплекса. Изменения в состоянии ионизации свободного фермента и субстрата не будут влиять на V; они могут оказывать влияние на Км, однако это влияние устраняется благодаря использованию высоких концентраций субстрата. Эти предпосылки значительно облегчают обсуждение вопроса.

Напомним уравнение v=k+2X (4.16), где х — концентрация комплекса ES; в присутствии избытка субстрата х становится равным суммарной концентрации фермента, т. е. V=k+2e [уравнение (4.17)]. Величина х равна сумме концентраций всех ионных форм комплекса, поэтому ее можно обозначить также через xt ( = полная концентрация комплекса). Но так как мы уже часто использовали х именно в этом смысле, то и в дальнейшем мы будем опускать индекс t; аналогично мы будем поступать и в отношении символа е. Константа скорости k+2 относится ко всему количеству комплекса, и она должна изменяться в зависимости от рН. Это изменение вызвано тем обстоятельством (на мысль о нем наводит уже рассмотрение кривых, характеризующих зависимость активности от рН), что распадается только одна ионная форма комплекса (или по крайней мере только одна форма распадается быстрее, чем все другие) и что доля всего комплекса, находящаяся в этой форме, изменяется с изменением рН. Таким образом, k+2 определяется двумя величинами: константой скорости распада опредеГлава 4

ленной ионной формы комплекса (которая не зависит от рН и

которую мы обозначим через k+2) и соответствующей рН-функ-цией, которая определяет концентрацию этой ионной формы при данном значении рН Тот факт, что скорость реакции падает по обе стороны от оптимума рН, указывает, что активное состояние является промежуточной ионной формой, так что входящая в выражение для k+2 рН-функция представляет собой по форме выражение для /~ [уравнение (4 228)]. Таким образом, мы имеем i

*а=-|±*-, (4.254)

+ I es

где индекс es относится к комплексу ES. Так как нам неизвестна природа ионизирующихся групп фермента, которые влияют на его активность или определяют активную ионную форму комплекса, то будет удобно обозначить последнюю через ES" (ср. [70]), где п — суммарный отрицательный заряд, который несет активная форма. Тогда

v=k+2~-, (4.255)

где k+2 — константа скорости распада ES", x/f~es — концентрация ES". Выражение для V получается при подстановке х=е, и оно может быть представлено как

v=-и*'2* к > <4-256>

+ Ken + Н

где Kesi — константа ионизации комплекса, которая определяет «кислую» ветвь кривой рН — активность, и Kes2 — константа ионизации, определяющая «щелочную» ветвь этой кривой. Аналогичное уравнение было введено Валеем [4946].

В основе приведенных рассуждений лежит допущение, согласно которому процессы ионизации протекают достаточно быстро по сравнению с образованием и распадом фермент-субстратного комплекса, так что различные ионные формы каждого из компонентов системы находятся в равновесии между собой. Принимая во внимание природу процессов, это допущение, по-видимому, можно считать справедливым Лайдлер [2683] вывел полные уравнения, не делая этого допущения, но

страница 47
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Ферменты. Том 1" (3.77Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(16.09.2019)