Биологический каталог




Ферменты. Том 1

Автор М.Диксон, Э.Уэбб

ение скорости будет иметь вид

"н. b +«*ЛЛ, ь )1«мв , */*мвЛ, ь V (4"223)

1+ ЛУ + a V+ Ki' /+ Ь + ab \1+ Kt J

В этом случае графики зависимости l/v от 1/а, очевидно, будут линейными при всех концентрациях В, однако ни наклоны прямых, ни длины отсекаемых ими отрезков не будут линейными функциями 1/6. Как и в случае бесконкурентного ингибирования, K'i не обязательно является простой константой диссоциации ингибирующего субстрата из тройного (или четверного) комплекса. Дальциль [956] отметил, что, поскольку К\ не является истинной константой диссоциации, в то время как Ki есть истинная константа диссоциации комплекса ЕВ, даже в случае, когда константы диссоциации двух комплексов ингибирующего субстрата с ферментом равны, не будет наблюдаться истинное неконкурентное ингибирование.

Ингибирование смешанного типа при высоких концентрациях субстрата наблюдали в случае алкогольдегидрогеназы печени (КФ 1.1.1.1) [803].

Субстрат, действующий одновременно как активатор фермента

В предыдущем разделе рассматривались случаи, когда субстрат действовал одновременно как ингибитор, однако субстрат может выступать и в роли активатора фермента. Фумарат-гидратаза (КФ 4.2.1.2), например, активируется анионами [ЗОЮ], и так как сами молекулы субстрата являются анионами, то весьма вероятно, что они в дополнение к своей обычной " функции субстрата могут действовать и как активаторы ферГлава 4

мента. Массей [3012] предположил, что молекулы субстрата связываются с фумаразой не только в активном центре, но и в других участках. Имеется несколько возможных путей взаимодействия активатора с ферментом; этот вопрос обсуждается в гл. 8. Если активатор является также и субстратом, то следует учитывать образование минимум трех комплексов: фермент-субстратного комплекса (ES), комплекса, в котором субстрат связывается как активатор (ESa), и комплекса, содержащего как активатор, так и субстрат (ESaS). Взаимодействие фермента с субстратом и активатором может быть упорядоченным или неупорядоченным, оно может осуществляться в равновесных или стационарных условиях. Кроме того, комплекс ES может быть неактивным либо частично активным.

Кинетические уравнения для этих систем сходны с уравнениями для двухсубстратных реакций; во всех случаях в знаменателе уравнения скорости имеется член, содержащий s2; исключение составляет неупорядоченная система в стационарных условиях, для которой показатель степени больше двух (с. 135—137).

Для упорядоченной системы

Е ESa =j=fc ESaS (4.224)

t_I

p

уравнение скорости для стационарных условий имеет вид

V=-V KsKsM , (4-225)

где Ksm.— константа Михаэлиса для S, действующего как субстрат, а Kss — кажущаяся константа диссоциации комплекса ESa (с. 138). Для неупорядоченной равновесной системы уравнение скорости имеет такой же вид, как (4.179); это уравнение обсуждалось в связи с функционированием ферментов, действующих на две молекулы одного субстрата (с. 171).

Таким уравнениям обычно соответствуют нелинейные графики двойных обратных величин. Например, уравнение, обратное (4.225), имеет вид

4=4 + ^4- + i^i_ i_. (4.226)

При высокой концентрации субстрата последний член становится пренебрежимо малым, особенно если K.ss относительно невелико, и в этих условиях график приближается к прямой, которой отвечает константа Михаэлиса Ksm^- На рис. 4.44 приведено несколько теоретических кривых, соответствующих t

Кинетика действия ферментов Рис. 4.44. Влияние субстрата, дей-

тт 1 и iw

ствующего как активатор. для s ' всех кривых a"sm' = 0,01. /V у

зависимости (4.226). Константа Михаэлиса Ksm> произвольно выбрана равной 0,01 для всех кривых. Видно, что все кривые значительно отклоняются от пунктирной прямой, которая построена для данного значения константы Михаэлиса в предположении, что субстрат не активирует фермент.

Можно показать, что все эти кривые при l/s = 0 имеют такой же наклон, как и пунктирная прямая; однако по мере увеличения l/s они расходятся тем больше, чем больше Kss- Если Kss мала по сравнению с KSM' (кривая /, для которой Kss/Ksm.' — = 0,1), отклонение от прямой относительно невелико; однако при больших Kss (кривые // и III, для которых KSS/KSM' равно 1,0 и 10 соответственно) отклонение может быть весьма значительным, что не позволяет определить константу Михаэлиса.

В другом случае указанием на активацию субстратом может стать отклонение графика двойных обратных величин вниз от прямой. Такая картина может быть обусловлена действием двух ферментов (с. 118—121); если, однако, в системе имеется только один фермент, она может трактоваться как результат связывания ферментом более чем одной молекулы субстрата. Такое поведение фермента более подробно обсуждается в гл. 8.

В. ВЛИЯНИЕ рН

Ферменты, вообще говоря, активны только в определенном интервале рН, и в большинстве случаев для действия каждого фермента имеется определенный оптимум pj-L^ Наличие такого оптимума может иметь несколько причин: 1) истинное обратимое влияние рН на скорость реакции V (в условиях, когда фермент насыщен субстратом); 2) влияние рН на сродство фермента к субстрату (в этом случае падение активности по обе стороны от оптимума рН будет следствием понижения насыщения фермента субстратом в силу понижения сродства); 3) влияние Глава 4

рН на стабильность фермента, который может необратимо ин-активироваться при рН по одну или по обе стороны от оптимума. Перечисленные факторы могут действовать и в комбинации друг с другом; например, падение активности по одну сторону от оптимума рН может быть результатом" уменьшения сродства фермента"'к субстрату, а по другую — результатом инактивации фермента.

Действие рассматриваемых факторов можно легко различить экспериментальным путем. Наличие необратимой инактивации устанавливают, сначала инкубируя фермент в растворах с различными значениями рН^ а затем определяя его активность по возвращении рН к определенному значению. На рис. 4.45 приведены результаты опытов такого рода для моноамин-оксидазы (КФ 1.4.3.4), из которых видно, что падение активности в щелочной области (по отношению к оптимуму рН) вызвано инактивацией фермента. Так как степень инактивации фермента со временем увеличивается, то и форма кривой, и положение кажущегося оптимума рН зависят от времени, в течение которого проводятся наблюдения; если бы можно было определить истинные начальные скорости сразу же после приведения раствора фермента к определенному значению рН, то тогда фактор инактивации был бы полностью исключен. Наблюдаемый оптимум рН аналогичен ложному «температурному оптимуму», который мы рассмотрим ниже.

Влияние рН на сродство фермента к субстрату можно исключить, если работать с такими концентрациями субстрата, которые достаточно высоки, чтобы насытить фермент при всех изучаемых значениях рН. Так как величина Кш может значительно изменяться при сдвиге рН, то мы отнюдь не вправе считать, что концентрация субстрата, достаточная для насыРис. 4 45. Влияние рН на активность моноаминоксидазы (флавинсодержащей) (КФ 1 4 34) [1784]. /—активность при рН, указанных на оси абсцисс, II — активность при рН 7,3 после инкубации в течение 5 мин при рН, указанных

иа оси абсцисс.

Кинетика действия ферментов щения фермента при одном из значений рН, будет достаточной для его насыщения и при других значениях рН. Чтобы определить влияяш^^з^енений собственно рН на активность фермента, необходимо получить достаточное количество данных по зависимости скорости_р_егШЩяГот концентрации субстрата при каждом значемй^Н, а затем с помощью одного из графических методов, показанных на рис. 4.12, найти значения__У_и_Дм-Большинство приводимых в литературе кривых, характеризующих влияние рН на активность" фермента", представляет собой сложные кривТ5ё7~ф^р1лаПШтор~ых зависит частично от изменений V, а частично~бт*изменений Км- Кривые, иллюстрирующие влияние изменения рН на ^тгт^мТприведены ниже

Влияние рН на активность ферментов, подобно всем другим видам влияния рН, осуществляется путем изменения в состоянии ионизацш1^хделкыых компонентов системы при изтйе~нетгии рН. Такие изменения могут происходить в свободном ферменте, в фермент-субстратном комплексе или субстрате. Поскольку ферменты представляют собой белки, молекулы которых содержат большое число ионизирующихся групп, то они могут находиться в виде целого ряда различных ионных форм, причем распределение^ всего количества фермента между этими ионными формами Зависит от рН и от констант ионизации различных групп. Поскольку, однако, каталитическая активность наблюдается обычно в относительно небольшом интервале значений; рН, можно думать, что только одна из ионных форм фермента (или, точнее, его активного центра) каталитически активна, как это и предполагали Михаэлис и Дэвидсон [3148] еще в 1911 г„ Имеется ряд соображений в пользу того, что ионизация тех групп в ферменте, которые удалены от активного центра, либо оказывает незначительное влияние, либо совсем не оказывает влияния на

страница 44
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Ферменты. Том 1" (3.77Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(20.11.2018)