Биологический каталог




Ферменты. Том 1

Автор М.Диксон, Э.Уэбб

(4.211)

Кинетика действия ферментов Рис. 4.35. Определение величины Ki% по ингибированию реакции избытком субстрата [3305]. Гидролиз этилбутирата карбоксилэстеразой (К Ф 3.1.1.1.) из печени ов-

-K's 0 10 20 -50 40-10~3М

или в обратной форме

V

На рис. 4.35 изображен график зависимости 1/у от s для случая действия карбоксилэстеразы печени при высоких концентрациях субстрата, построенный по данным Мюррея [3305]. Точка пересечения данной прямой с осью абсцисс дает значение Kis, равное 0,010 М. Значение, полученное Мюрреем по тем же данным, но более трудоемким путем, равно 0,0097 М. Когда ферментативная реакция протекает в две стадии (с. 274), например когда эстераза вначале ацилируется с освобождением спирта, входившего в состав субстрата, а затем деацилируется, вторая молекула субстрата, взаимодействуя со связывающим спирт участком ацилированного фермента, может ингибировать деацилирование. Субстратное ингибироваиие ацетилхолинэсте-разы обусловлено, по-видимому, подобного рода взаимодействием [2615].

На графике зависимости l/v от s (рис. 4.35) линейный участок справа соответствует области, в которой член Км/s, входящий в уравнение (4.208), пренебрежимо мал, а участок вдоль вертикальной оси соответствует области, в которой мал член s/Kis- Хотя рассмотренный график имеет почти такой же вид, как график зависимости l/v от l/s, однако две его части как бы меняются местами, так что области, в которой член s/Kis пренебрежимо мал, отвечает прямая в правой части графика, в то время как область, в которой мал член Дм/s. располагается вдоль вертикальной оси.

Уравнение (4.208), как и следовало ожидать, по форме весьма близко к уравнению, описывающему влияние рН на актив-

KtsV

(4.212) Глава 4

ность фермента, когда присоединение к ферменту одного водородного иона приводит к появлению активности, а присоединение второго водородного иона «выключает» ее [см., например, уравнения (4.228) и (4.256), а также среднюю кривую на рис. 4.46]; если построить график зависимости v от lgs, то мы получим обычную колоколообразную кривую с симметричным пиком при оптимальной концентрации субстрата.

Уэстли [5057, с. 51] предположил, что, поскольку ингибирование высокой концентрацией субстрата обусловлено связыванием двух молекул субстрата в неправильной по отношению к активному центру фермента ориентации, возможно, что некоторая доля связанных молекул субстрата ориентирована неправильно даже и при низкой концентрации субстрата, когда не наблюдается субстратного ингибирования. Схема реакции при ингибировании в результате неправильного связывания следующая:

ES'

"!

E?=±ES-*Е+Р. (4.213)

ES'— комплекс, в котором субстрат ориентирован неправильно. Такая схема является фактически случаем конкурентного ингибирования, когда субстрат конкурирует сам с собой (см. гл. 8). Уравнение скорости для стационарных условий имеет вид

(4.214)

На рис. 4.36 график двойных обратных величин для системы, подчиняющейся этому уравнению, сопоставлен с графиком для

Кинетика действия ферментов

189>

Рис. 4.37. Гидролитическое действие дрожжевой (З-В-фруктофуранозидазы? (К Ф 3.2.1.26) в условиях высокой концентрации сахарозы — влияние уменьшения концентрации воды [3390]. А. Скорость реакции как функция концентрации сахарозы. Б. Скорость реакции как функция концентрации воды. / — раствор сахарозы; // — то же+10%-ный спирт; 111—то же+20%-ный спирт»

системы, в которой не происходит неправильного связывания. Ситуация, описываемая этим уравнением, не приводит к типичному ингибированию высокими концентрациями субстрата; если, однако, при неправильном связывании субстрата некоторые связывающие участки фермента остаются свободными, то с образовавшимся комплексом может связываться вторая молекула субстрата

ES' —-fc ES2'

Е ч=^ ES -*¦ Е -f- Р, (4.215)

и уравнение стационарной скорости имеет вид

^ г Kts

где Kis — константа диссоциации для реакции ES/=E + S, а К^" является более сложной величиной, чем простая константа диссоциации. График двойных обратных величин для ферментов, подчиняющихся этой схеме, приведен на рис. 4.36.

2. Поскольку все ферменты функционируют в водной среде,, то при очень высокой концентрации субстрата будет уменьшаться концентрация воды, что может снижать скорость реакции» особенно если вода является одним из реагентов. Такой пример приведен на рис. 4.37; ингибироваиие дрожжевой 6 = 0-фрукто-фуранозидазы (КФ 3.2.1.26) в условиях высоких концентраций Глава 4

•сахарозы связывают с уменьшением концентрации воды [3390]. Было показано, что в широком диапазоне концентраций сахарозы скорость является функцией концентрации воды, при этом не имеет значения, чем вызвано уменьшение концентрации воды — добавлением сахарозы или спирта (см. рис. 4.37,Б). -Следует указать на возникшее в этих экспериментах осложнение: в присутствии спирта фермент наряду с гидролизом катализирует перенос остатков фруктозы на спирт, что приводит к кажущемуся снижению скорости гидролиза [222]; однако ингибирование высокой концентрацией сахарозы не может быть обусловлено переносом фруктозы на сахарозу [221].

3. На рис. 4.38 приведена зависимость скорости восстановления метиленового синего от концентрации гипоксантина в присутствии ксантиноксидазы (КФ 1.2.3.2) [1120]. Ингибирова-яие при высокой концентрации субстрата является результатом конкуренции с метиленовым синим; на это указывает тот факт, что эффективное сродство к красителю уменьшается в 20 раз при увеличении концентрации субстрата от А до В. Это частный случай конкурентного ингибирования, при котором один субстрат является конкурентным ингибитором другого. Аналогичным примером может служить действие полученной из змеиного яда оксидазы L-аминокислот (КФ 1.4.3.2) [4301]. Этот фермент был детально изучен, причем в качестве субстрата использовался лейцин, а в качестве акцептора водорода — метилено-вый синий [1119]. На рис. 4.39 изображена зависимость l/v от концентрации лейцина при различных концентрациях метиленового синего. s? 1000

о О

О

1,0

20 w"JVf

Рис. 4.38. Ингибирование реакции при повышении концентрации субстрата [1120]. Фермент — ксан-тнноксидаза (К Ф 1.2.3.2).

Кинетика действия ферментов

19L

± т/

и I о/

15 > /о

10 То /

5. 1---"^|/ / ... . _J —* 1

I----1^ /-1-.-1-1-5—

-10 -5 0 5 Ю-Ю^М

Рис. 4.39. Конкурентное! ингибирование избытком субстрата [1119]. Окисление-лейцина метиленовым синим под действием оксидазы L-аминокислот из змеиного яда (КФ 1.4.3.2). Кривые построены для различных концентраций ме-тнленового синего: / — 0,344-Ю-4 М; // — 0,67-10~4 М; /// — 1,34-10~4 М;

/V —2,67-10-* М.

При сравнении этого графика с графиком на рис. 8.3, Л (см. также рис. 4.34, Г и 4.35) становится очевидным, что лейцин действует как ингибитор, конкурирующий с метиленовым синим. Точка пересечения кривых (соответствующая —Ki в случае обычного ингибитора) характеризует величину константы диссоциации субстрата, когда он действует как ингибитор.

4. Кажущееся ингибирование при высокой концентрации субстрата наблюдается при действии неорганической пирофос-фатазы (КФ 3.6.1.1) [239]. В реакции участвует дополнительный фактор, Mg, который является необходимым для протекания реакции активатором. Рис. 4.40 иллюстрирует влияние различных концентраций пирофосфата на величину относительной скорости ф при постоянной концентрации Mg, равной 0,004 М. Концентрации пирофосфата, вызывающие ингибирование, значительно превышают те, которые необходимы для насыщения фермента субстратом, так что максимальная скорость наблюдается в широком диапазоне концентраций пирофосфата.

Для этого случая ингибирования были предложены два разных объяснения; оба они исходят из предположения об образовании комплекса магний — пирофосфат. Первое объяснение [1911] состоит в том, что избыток субстрата связывает магний и Глава 4

-4,5 -4,0 -3,5 -ДО -2,5 -2,0 -1,5 lg [пирофосфат]

Рис. 4.40. Зависимость скорости реакции, катализируемой неорганической пирофосфатазой (К Ф 3.6.1.1), от концентрации субстрата в присутствии 0,004 М MgCl2 [239].

таким образом понижает эффективную концентрацию активатора фермента, в результате чего скорость реакции уменьшается; когда же концентрация свободных ионов Mg2+ падает до нуля, фермент становится неактивным. Другое объяснение [464] связано с допущением (в пользу которого говорят некоторые данные), что истинным субстратом фермента служит ион (MgF^O?)2-, а не свободный пирофосфат. Полагают, что ингибирование является следствием конкуренции пирофосфата с истинным субстратом. Во всяком случае, рассматриваемое влияние высоких концентраций пирофосфата нельзя считать истинным ингибированием, так как если изменять соотношение концентраций Mg и пирофосфата таким образом, чтобы удержать пирофосфат в составе комплекса с магнием, то ингибирование оказывается значительно меньшим (рис. 4.41). При работе

страница 42
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Ферменты. Том 1" (3.77Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(20.11.2018)