Биологический каталог




Ферменты. Том 1

Автор М.Диксон, Э.Уэбб

лико, то придется вводить субстрат в очень малой концентрации. В таких условиях значительная часть субстрата может оказаться связанной с ферментом и концентрация свободного субстрата (s) будет существенно отличаться от суммарной концентрации субстрата (st). Вместо уравнения (4.192) в таком случае необходимо использовать следующее:

Ks={et-X)^-X)=[^~ (4.199)

где st — суммарная концентрация связанного и свободного субстрата, a et — суммарная концентрация фермента. Удобный графический метод, которым можно воспользоваться в подобном случае (а также и в «обычных» условиях), был предложен М. Диксоном [1114]; о нем уже упоминалось на с. 101 —102. Метод основан на построении графика зависимости х (или v, которая является мерой х) от s< (или s в обычных условиях), как показано на рис. 4.12, ? и более детально на рис. 4.32. Следует отметить, что при s* = s график является равнобочной гиперболой, если же s<#s, он будет неравнобочной гиперболой.

На рис. 4.32 приведен график зависимости скорости от концентрации субстрата для случая, когда концентрацией фермента нельзя пренебречь по сравнению с концентрацией субстрата в отличие от рис. 4.12, Е, где величина et пренебрежимо мала. Сначала проводят горизонтальную прямую, отвечающую максимальной скорости V, определенной при насыщающей концентрации субстрата. Затем на кривой отмечают точки, лежащие на уровне V/n, где п = 2, 3, 4 и проводят через эти точки прямые, проходящие через начало координат, которые пересекают У-прямую в точках s2, s3, S4.... (Легко показать, что прямая при п=\ является касательной к кривой в начале координат, однако ее трудно провести с достаточной точностью.) Глава 4

Рис. 4 32. Графический метод Диксона: определение молярной концентрации фермента [1114].

Обозначив через v' и х' координаты точки V/n на кривой, получаем v'=V-

и поскольку v' = kx' и V=ket, то

я— 1

kx' =ket-

или е,—х —

et

(4.200)

(4.201) (4.202)

п * п

Подставляя в (4.199), получаем

где s't — величина St в точке V/n кривой. Если через sn обозначить величину st в точке пересечения /г-прямой с У-прямой (опустив штрих), то из (4.200), используя свойства подобных треугольников, находим

°п——Zт °* • Подставляя в (4.202), получаем

ДМ--п й~»

(4.203)

(4.204) (4.205)

Расстояние между двумя соседними точками пересечения будет равно

^.-Vi-Km. (4-206)

Следовательно, все расстояния между точками пересечения с V-прямой равны и соответствуют значению /См в единицах, отложенных по оси абсцисс.

Кинетика действия ферментов Рис. 4.33. Метод определения концентраций компонентов для любой точки графика зависимости скорости от концентрации [1114].

Точность метода зависит главным образом от того, на правильном ли уровне проведена V-прямая. Хорошим контролем при этом является постоянство расстояний между соседними точками пересечения: если прямая проведена выше, чем следует, интервалы будут увеличиваться в направлении слева направо, если же она проведена ниже, то интервалы будут уменьшаться в этом направлении.

Отложив расстояние, равное Км, влево от s\, мы получим точку s0; уравнение (4.205) показывает, что эта точка соответствует полной концентрации фермента в соответствующих единицах. Если концентрация фермента пренебрежимо мала по сравнению с концентрацией субстрата (обычная предпосылка при выведении кинетических уравнений), то So-прямая совпадает с осью ординат, как на рис. 4.12, Е. С другой стороны, если et достаточно велика, можно довольно просто определить концентрации различных компонентов системы (полную концентрацию фермента, концентрацию свободного фермента, полную концентрацию субстрата, концентрацию свободного субстрата, Глава 4

концентрацию фермент-субстратного комплекса) для любой точки кривой; для этого достаточно провести горизонтальную прямую влево от соответствующей точки. Эта процедура проиллюстрирована на рис. 4.33, где приведена начальная часть графика рис. 4.32 в увеличенном масштабе. Принцип расчета становится ясным, если учесть, что v пропорциональна концентрации ES. Длины всех приведенных отрезков отвечают концентрациям соответствующих компонентов.

Ингибирование высокими концентрациями субстрата а. Односубстратные реакции

Довольно часто ферментативные реакции, подчиняясь закону Михаэлиса при низких концентрациях субстрата, замедляются при высоких его концентрациях. Подобное явление может быть обусловлено разными причинами.

1. Исследование специфичности ферментов дает основание предполагать, что многие ферменты имеют несколько химических групп, каждая из которых взаимодействует с определенной частью молекулы субстрата (рис. 10.23). В эффективном фермент-субстратном комплексе молекула субстрата контактирует со всеми этими группами; однако можно представить себе образование неэффективного комплекса, в котором одни связывающие группы взаимодействуют с данной молекулой субстрата, а другие — со следующей молекулой. При высоких концентрациях субстрата, когда большое число молекул последнего окружает фермент, шансы на образование неэффективного комплекса (в котором к активному центру фермента присоединены две или несколько молекул субстрата) увеличиваются. Такая возможность представлена следующей системой:

k к

Е =F=fc ES -¦ Е + Продукты. (4.207)

ES2

Впервые эта система была проанализирована Холдейном [1749, с. 83] в предположении, что субстрат связывается в равновесных условиях. Анализ системы (4.207) как для стационарных, так и для равновесных условий приводит к одному и тому же уравнению, а именно:

V

"1 + i^L + ^L-

(4.208)

где константа Д"м, как обычно, равна k-i/k+t в равновесии и

Кинетика действия ферментов {k-\ +k+2)/k+i в стационарных условиях; Ki3 в обоих случаях равна ks/k+з.

Используя относительную концентрацию

получаем

Ф=-ji—j-. (4.210)

На рис. 4.34 это стандартное уравнение представлено графически различными способами, причем величина г произвольно принята равной 100, что согласуется, однако, с экспериментально полученным значением г для реакции, в ходе которой карб-оксилэстераза печени (КФ 3.1.1.1) катализирует превращение этилового эфира миндальной кислоты [269]. Необходимо отметить, что, хотя величины К существенно отличаются друг от друга, определяемая максимальное значение <р значительно меньше 1; другими словами, v начинает уменьшаться, так и не достигнув V. Следовательно, попытки рассчитать Км. по графику рис. 4.34, Л или 4.34, ? дали бы ошибочные результаты, если принять экспериментально определяемую максимальную скорость за V. График, в котором по обеим осям отложены обратные величины (рис. 4.34,В), позволяет избежать этой ошибки, так как здесь удачно используются данные для низких концентраций субстрата, и в результате большая часть кривой лежит в области, в которой выполняется уравнение Михаэлиса. Истинное значение 1/V можно найти по экспериментальным данным с помощью графика, построенного в обратных координатах, так как этот график пересекает вертикальную ось при 1Др=1. Используя это значение V, можно определить г по графику А или Б, как это доказано на рис. 4.34. Наибольшая относительная скорость У г/ (2+Уг) достигается при концентрации субстрата, равной УКмК^, что соответствует относительной концентрации, равной Уг. Кривая, построенная в полулогарифмическом масштабе (рис. 4.34,Б), симметрична относительно этой величины. г можно найти непосредственно из графика зависимости 1Др от а (как это показано на рис. 4.34, Г) путем продолжения прямой, полученной при высоких значениях «т, до пересечения с осью абсцисс. Основанием для этого служит то, что при высокой концентрации субстрата величина Км/s в уравнении (4.208) становится пренебрежимо малой и основное значение приобреГлава 4

Рис. 4.34. Ингибирование реакции при высокой концентрации субстрата — нормированные кривые, построенные для произвольно выбранной величины г=» = KislKm= 100 (рис. 4.11). А. Зависимость <р от а (пунктирная линия показывает ход кривой в отсутствие ингибирования избытком субстрата). Б. Зависимость ф от lgcr. Следует обратить внимание на то, что при изменении знака левая ветвь кривой соответствует графику на рис. 4.11, Б. Кривая симметрична относительно величины а=^г, и при q>=0,5 ширина равна Igr, следовательно, абсцисса точки перегиба левой ветви кривой равна нулю. В. Зависимость 1/ф от 1/сг. Приведенные на графике теоретические точки на значительном протяжении ложатся на прямую с наклоном, равным единице (см. рис. 4.11, Л). Небольшой изгиб кривой вверх при малых значениях 1/а отражает ингибирование реакции избытком субстрата. Г. Зависимость 1/ф от о*. Точки, лежащие на прямой, соответствуют условиям ингибирования реакции избытком субстрата; те же точки, которые на рис. 4.34, В лежат на прямой, теперь расположены на загибающейся вверх части кривой, т. е. при малых значениях о*.

тает величина, определяющая ингибирование. Подставив в уравнение V вместо ke, получим

страница 41
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Ферменты. Том 1" (3.77Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(19.10.2018)