Биологический каталог




Ферменты. Том 1

Автор М.Диксон, Э.Уэбб

обно рассматривать в этой книге столь сложные системы и ограничимся изложением только ряда общих вопросов. Глава 4

Механизмы реакций с участием трех и большего числа субстратов аналогичны механизмам, характерным для двухсубстратных реакций; однако иногда встречаются системы, в которых сочетаются несколько механизмов (гибридные механизмы). Трехсубстратные системы могут функционировать по полностью неупорядоченному или полностью упорядоченному механизму; кроме того, два субстрата могут взаимодействовать по типу двухстадийного переноса или в соответствии с механизмом Теорелла— Чанса, в то время как третий субстрат функционирует на участке реакционного пути с упорядоченной последовательностью, образуя тройной комплекс, например

Е <—^ ЕА <—v Е'Р т-г>- Е' <—>¦ Е'В Е'ВС 7==fc

EQP =5=_ ER =F==t Е, (4.182) с

Е ЕА <—^ ЕАВ EPQ «—^ EQ т=—: Е, (4.183)

R

где А, В и С — субстраты, а Р, Q и R — продукты. Встречаются также «гибридные» неупорядоченно-упорядоченные системы, например

ЕАВ EPQ Е^ЕА EABC^EPQR ЕР^Е. /4 1§4ч

EAC EPR

Ясно, что приведенные здесь случаи далеко не исчерпывают всех возможных механизмов реакций с участием трех и более субстратов. Эти' реакции можно, однако, исследовать таким же путем, что и двухсубстратные реакции. Как и для последних, последовательности, в которых два (или более) субстрата связываются с ферментом неупорядоченно, характеризуются в стационарных условиях нелинейными графиками двойных обратных величин; для равновесных условий эти графики линейны. Конечно, в системах с участием двух и более субстратов связывание одних субстратов может происходить равновесным образом, в то время как связывание других — стационарным. Общий метод вывода уравнений начальной скорости для систем, включающих как равновесные, так и стационарные стадии, был предложен Ча [720].

Общее кинетическое уравнение для трехсубстратной реакции, которой отвечает линейный график двойных обратных величин, имеет следующий вид: __V_

< а + 0 ~т~ с ~т~ ab ~т~ ас be abc

(4.185)

Кинетика действия ферментов Здесь KktA, Кв1л и Kcni — истинные константы Михаэлиса для субстратов А, В и С соответственно, т. е. каждая константа характеризует концентрацию субстрата, при которой наблюдается скорость, равная половине максимальной (при насыщающих концентрациях двух других субстратов). Константы КАВ, КАС, Квс и КАЪС являются комбинацией констант Михаэлиса и кажущихся констант диссоциации, их смысл зависит от характера превалирующего механизма1. Если, например, концентрации В и С становятся достаточно высокими, то уравнение (4.185) упрощается:

» = —У—т. (4Л86)

1 , Ам

Если же существенно увеличивается концентрация только одного из субстратов (например, С), то уравнение (4.185) переходит в

1_г а + 6 + ab

которое фактически идентично (4.86); таким образом, если концентрация одного из субстратов является насыщающей, трех-субстратные реакции могут анализироваться таким же образом, как двухсубстратные.

Константы для систем, подчиняющихся уравнению (4.185), можно определить графически. Для этого строят серию графиков двойных обратных величин для каждого из субстратов при ряде концентраций одного из двух других субстратов (поочередно), определяют наклоны соответствующих прямых и длины отсекаемых ими отрезков и строят вторичные графики таким же образом, как для двухсубстратных реакций; поскольку, однако, в процессе участвуют три субстрата, можно затем построить еще одну серию вторичных графиков — каждую при разных концентрациях третьего субстрата; далее наклоны и отрезки этих вторичных графиков можно отложить в зависимости от

1 О кинетической номенклатуре. К сожалению, общепринятая номенклатура для кинетических констант, входящих в уравнения начальной скорости, отсутствует; в настоящее время используется несколько вариантов обозначений. В этой книге принята система, рекомендованная Международным биохимическим союзом. Уравнение, обратное (4 86), Дальциль записывает в виде

Т =ф° + # + ТвТ+Тав]-- (4л88)

Другие авторы используют уравнение (4.86) с другими символами для обозначения кинетических констант. Перечень различных констант приведен, например, в работах [802, 4750]. Глава 4

\

обратной концентрации третьего субстрата (третичные графики). В табл. 4.9 показано, как определить по этим графикам константы, входящие в уравнение (4.185). В работе [962] приведены соотношения Дальциля между различными константами, весьма полезные для определения кинетического механизма реакции.

Как и в случае двухсубстратных систем, некоторые константы, входящие в уравнение (4.185), для отдельных механизмов становятся равными нулю. Особенно интересны упорядоченные системы (в том числе такие, в которых два субстрата участвуют в процессе Теорелла — Чанса или в двухстадийном переносе), поскольку в этом случае в уравнении скорости отсутствует комбинированная константа для субстратов, которые присоединяются не друг за другом. Так, для анализа последовательности

Е —=* ЕА т-=> ЕАВ ЕАВС ч=— EPQR ц—f

ч=_ EPQ ЕР : Е (4.189)

применимо уравнение (4.185), не содержащее константу КАС; при достаточно большой концентрации «среднего» субстрата (В) это уравнение упрощается до

'тж—: (4',90)

' а с

Графики двойных обратных величин для этого уравнения образуют семейство параллельных прямых при переменной концентрации одного из субстратов и фиксированной концентрации другого. Следует отметить, что система (4.189) при насыщающих концентрациях любого из двух других субстратов (кроме «среднего») характеризуется уравнением такого же вида, как и (4.187); следовательно, если при построении одной из серии графиков двойных обратных величин образуется семейство параллельных прямых, это означает, что соответствующий субстрат является «средним» [1418].

Для установления кинетического механизма в случае фермента, взаимодействующего с тремя или большим числом субстратов, можно исследовать характер ингибирования реакций продуктом [803, 1235, 3701, 4023]; имеются данные и по применению для этой цели «тупиковых» ингибиторов [1449, 2090].

Исследование связывания субстрата

Во многих случаях удается прямо исследовать связывание субстрата с ферментом. Так, для системы

Е + S т-г-у ES

(4.191)

Таблица 4.9

Выражения, определяющие наклоны графиков двойных обратных величии и длины отсекаемых ими отрезков (по отношению к субстрату А), для систем, подчиняющихся уравнению (4.185)

График

Наклон

Длина отрезка, отсекаемого ог оси

i/o

Первичный график: l/v — 1/а

Вторичные графики:

(1) Длина отрезка—1/Ь

(2) Длина отрезка—1/с

(3) Наклон — 1/Ь

(4) Наклон — 1/с

Третичные графики: Длина отрезка (1) — 1/с

Наклон (1) — 1/с

Длина отрезка (2) — 1/Ь

Наклон (2) — 1/Ь

Длина отрезка (3) — 1/с Наклон (3) — 1/с Длина отрезка (4) — 1/Ь Наклон (4) — 1/Ь

^АВ ^АС ^АВС

be

кв

К'

ВС

м"

К

ВС

К

AB

К

ABC

кАС + -

V

*м V

квс

ЛВС

К

АС

К

ABC

К

АВ

К

АБС

ВС

Ь с 6с

1 +

м

1 + Дм.

л-А л. —

АС

АВ

К

м

л

м

л"

м

АВ

АС Глава 4

можно следить за образованием комплекса ES при различных концентрациях S, если имеется способ определения концентрации комплекса.

Определять концентрацию ES можно различными физическими методами либо непосредственно, либо следя за уменьшением концентрации свободного S, обусловленным связыванием части его с ферментом. Клотц и др. [2490] применяли для этой цели равновесный диализ. В обычном варианте раствор фермента известного объема и концентрации помещают в диализный мешочек и диализуют до равновесия против раствора субстрата известного объема и концентрации. В выбранных условиях субстрат не должен претерпевать никаких превращений. После достижения равновесия определяют концентрацию субстрата в растворе, против которого производился анализ, и считают, что такова же концентрация свободного субстрата в растворе с ферментом (если можно пренебречь эффектом Донна-на). Зная общее количество введенного в систему субстрата и внося, если это необходимо, поправки на изменение объема, можно рассчитать количество субстрата, связанного с ферментом, а также число молекул субстрата, связанных одной молекулой фермента. Затем процедуру повторяют при ряде концентраций субстрата. При интерпретации результатов таких экспериментов следует соблюдать осторожность, так как известно, что некоторые соединения связываются со стенками диализного мешочка; в таком случае, чтобы получить достоверные результаты, необходимо внести поправку на связывание.

Процедура равновесного диализа занимает довольно много времени, что 'связано с медленным установлением равновесия между свободным субстратом по обе стороны мембраны. В связи с этим применяют два других, более быстрых метода. Метод ультрафильтрации отличается от метода равновесного д

страница 39
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Ферменты. Том 1" (3.77Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(11.12.2018)