Биологический каталог




Ферменты. Том 1

Автор М.Диксон, Э.Уэбб

о нуля. Как и раньше, пара В и ВХ подавляет обмен А*Х— А. Таким образом, по данным изотопного обмена теоретически удается различить очередность связывания субстратов и освобождения продуктов.

Простые схемы ингибирования, характерные для упорядоченного механизма, могут усложняться при образовании тупиковых ингибиторных комплексов. Так, можно предполагать, что обмен между В*Х и В в ходе реакции (4.169) не будет подавляться ни одной из пар реагентов. Если, однако, образуется тупиковый комплекс ЕАВ:

Е ц—у ЕАХ =г=± ЕАХВ я.—*¦ ЕАВХ ЕА ч—*• Е, (4.171)

ЕАВ

то насыщение парой А + В может привести к подавлению обмена В*Х— В в результате смещения равновесия в сторону образования тупикового комплекса и уменьшения концентрации соседних интермедиатов. Глава 4

Можно представить систему, в которой тупиковый комплекс образуется в результате одновременного связывания с ферментом АХ и ВХ:

Е 7—*¦ Е\Х <—* ЕАХВ «г-* ЕАВХ т—>• ЕА i- Е. (4.171а)

ЕАХВХ

Если, однако, X не очень мал по размеру, то он, возможно, будет связываться со специфическим участком на ферменте, и АХ и ВХ не смогут одновременно связываться с этим участком. Если же X — это, скажем, один или два атома водорода, то такое ограничение отпадает. Например, в случае функционирования дегидрогеназы NADH (=АХ) и NAD+ ( = А) могут связываться с одним участком, а восстановленная и окисленная формы субстрата — с другим, соседним участком, при этом атом Н, принадлежащий NADH, и атом Н восстановленного субстрата могут связываться одновременно, поскольку размеры их достаточно малы. Такая ситуация наблюдается при функционировании малатдегидрогеназы (КФ 1.1.1.37). Кинетическая последовательность для этого фермента сходна с (4.169):

Е т—* E.NADH т—г. Е.NADH.OA i—f E.NAD+.M i—>•

E.NAD+ E, (4.172)

где OA и M — оксалоацетат и малат соответственно. В работе [4289] было показано, что, как и следовало ожидать для такой системы, при Высоких концентрациях NAD++OA наблюдается подавление обмена между NAD+ и NADH, но не между М и OA. Однако при высоких концентрациях M + NADH наблюдается подавление обеих реакций. Эти данные проще всего объяснить образованием тупикового комплекса Е. NADH. М. Возможность таких осложнений показывает, что для получения убедительных данных желательно исследовать влияние на обменные реакции всех возможных пар субстрат — продукт.

В случае механизма Теорелла — Чанса характер ингибирования можно предсказать подобным же образом. Так, для механизма

ах в Е ч—>- ЕАХ <—^ ЕА Е (4 173)

вх a v • /

можно ожидать, например, что обмен между А*Х и А будет подавляться при насыщающих концентрациях А+В или АХ + ВХ, но не В + ВХ.

О реакциях обмена в системах с двухстадийным переносом говорилось выше. Клеланд [803] получил уравнение начальной

Кинетика действия ферментов скорости реакции обмена между А*Х и А для системы (4.164) — (4.165). Оно имеет вид

л-/х

V

КмАХ

ах г, а. (4-174)

1 +

KsAA . Ks

ах

где ах — концентрация АХ; аналогичное уравнение можно получить также для обмена В* — ВХ. Следовательно, графики зависимости величины, обратной скорости обмена, от \/ах образуют семейство параллельных прямых (для серии концентраций А); из вторичных графиков для длин отсекаемых отрезков можно далее определить кажущиеся константы диссоциации KsAX и /СА

В случае обратимой неупорядоченной системы _ ^

ЕАХ ЕА

7/ ^ 7/ ^

Е ^ ЕАХВ^ЕЛВХ Е (4.175)

^ ' 7/ ^ у/

ЕВ ЕВХ

наличие альтернативных путей для связывания каждой пары субстратов приводит к тому, что обменные реакции не подавляются ни одной из субстратных пар. Бойер [510, 515] предположил, что отсутствие ингибирования может быть использовано для отличия системы этого типа от упорядоченной. Однако этот критерий следует использовать с известной осторожностью; так, Уонг и Хейнс [5150] отметили, что упорядоченные системы, в которых тройные комплексы могут диссоциировать с образованием тупиковых комплексов, например

Е и—> ЕАХ ч—*¦ ЕАХВ —» ЕА ВХ ч—>- ЕА7—*• Е, (4.176)

ЕВ ЕВХ

ведут себя как системы, в которых реакции обмена не подавляются при увеличении концентрации любой субстратной пары. Следует отметить, что при образовании тупиковых комплексов в неупорядоченных равновесных системах может наблюдаться подавление обмена высокими концентрациями пар субстрат — продукт, как это было показано для галактокиназы (КФ 2.7.1.6) [1707]. Однако в таком случае возможность связывания каждого из реактантов с альтернативными формами (комплексами) фермента приводит к симметричной ситуации, при которой какая-либо пара реактантов, тормозящая одну из реакций обме? на, будет тормозить также и все остальные обменные реакции.

Особый случай использования реакции изотопного обмена-^ привлечение этого метода для выяснения вопроса о том, действ Глава 4

вительио ли неупорядоченная равновесная система находится в состоянии полного равновесия. В системе (4.175) стадии, на которых происходит связывание субстратов, будут равновесными в том случае, когда лимитирующими являются стадии взаимопревращения тройных комплексов (с. 134). Следовательно, если суммарная реакция для неупорядоченной системы является равновесной, все изотопные обменные реакции этой системы должны протекать с одинаковой скоростью, в то время как в случае упорядоченных систем это положение не является обязательным. Сопоставление скоростей обмена различных пар реактан-тов показало, что креатинкиназа (КФ 2.7.3.2) функционирует по неупорядоченному механизму и что система действительно находится в состоянии равновесия; в то же время было установлено, что в случае галактокиназы (КФ 2.7.1.6) из Е. coli и гексокиназы из дрожжей (КФ 2.7.1.1), функционирующих, как полагают, по неупорядоченному равновесному механизму, скорости изотопных обменных реакций соответствующих пар реак-тантов в ряде случаев различаются; это свидетельствует о том, что равновесные условия строго не соблюдаются.

Исследование обменных реакций позволяет также обнаружить второстепенные пути катализируемых ферментами реакций, поскольку происходящее при насыщении парой субстрат — продукт ингибирование может быть частично предотвращено, если есть возможность «обойти» блок. В таких случаях при увеличении концентрации пары субстрат — продукт скорость обмена будет снижаться до конечной величины. Частичное ингибирование наблюдали в случае алькогольдегидрогеназ дрожжей и печени (КФ 1.1.1.1) [4288] и лактат- и малатдегидрогеназ (КФ 1.1.1.27 и 1.1.1.37) при высоких значениях рН [4288, 4289]. В случае малатдегидрогеназы отсутствие полного ингибирования обмена NAD+ — NADH при насыщающих концентрациях пары оксалоацетат+малат связывают с (относительно медленной) диссоциацией тройных комплексов, приводящей к образованию комплексов Е.ОА и Е М, которые далее могут взаимодействовать с NADH и NAD+ соответственно; при этом образуются комплексы, находящиеся на пути реакций обмена

Е -г—>- E.NAD+ зт-> E.NAD+.M ч=— Е.NADH.OA 4—>-

Медленно

Медленно

Е.М

Е OA

(4.177)

Реакции между двумя молекулами субстрата

Фермент может катализировать реакцию между двумя идентичными субстратными молекулами; например, аденилаткиназа

Кинетика действия ферментов (КФ 2.7.4.3) катализирует реакцию

2ADP = АТР + Amp. (4.178)

В этом случае общее кинетическое уравнение для двухсубстрат-ной реакции (4.86) имеет вид

V=-F~a-j?-FaTa-. (4-179)

1 Am A M' As A m>

1+ a + a + a2

где КАм. и КАм.— константы Михаэлиса для первой и второй связывающихся с ферментом молекул субстрата. Для системы, подчиняющейся этому уравнению, график Михаэлиса является не равнобочной гиперболой, а сигмоидной кривой, график же двойных обратных величин представляет собой вогнутую кривую (см гл 8). Касательная к графику двойных обратных величин в точке пересечения с вертикальной осью отсекает на горизонтальной оси отрезок, равный —1/КАшКАш'-

Единственный случай, когда для такой системы график двойных обратных величин является линейным, — это наличие необратимой стадии между стадиями связывания первой и второй молекул субстрата (с. 133 и 140). В этом случае величина KSA оказывается равной нулю и уравнение (4.179) упрощается До

0=3-к А кА * (4Л80>

1 I Ам , А М' '-Г-~ + ~

Подобную ситуацию можно ожидать в том случае, если реакция протекает по механизму двухстадийного переноса: Е -г-т» ЕЛ ц—у Е'Р -<-^~ Е',

Е' ч=>: Е'А ч—у. EQ —>• Е. (4.181)

В случае систем типа (4.181) график двойных обратных величин не будет, однако, линейным, если реакция протекает при фиксированной концентрации продукта.

Реакции с участием трех и большего числа субстратов

Кинетика трехсубстратных реакций изучалась рядом исследователей; систематический анализ возможных путей реакций провел Дальциль [962]. Четырехсубстратные реакции встреча--ются редко, однако несколько случаев систем такого рода известно; их детальное исследование проведено Эллиоттом и Типто-ном [1235] Мы не имеем возможности подр

страница 38
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Ферменты. Том 1" (3.77Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(18.07.2018)