Биологический каталог




Ферменты. Том 1

Автор М.Диксон, Э.Уэбб

печени (КФ 1.1.1.1) в отличие от соответствующего фермента из дрожжей функционирует по механизму Теорелла — Чанса.

Использование соотношений Холдейна для выбора между упорядоченными механизмами с образованием тройных комплексов и механизмом Теорелла — Чанса требует, однако, определенной осторожности. Так, Дальциль указал, что в случае упорядоченного механизма с образованием одного тройного комплекса

(4.162)

при &_2С&+4 анализ системы с помощью соотношений Холдейна приводит к таким же соотношениям, как и в случае механизма Теорелла — Чанса, поскольку диссоциация тройного комплекса не является лимитирующей стадией.

е. Соотношения Дальциля

Как отмечал Дальциль [956], указание на механизм двух-субстратной реакции нередко могут дать соотношения между кинетическими константами. В табл. 4.8 приведены некоторые из соотношений, рассмотренных этим автором; заметим, что номенклатура Далыциля отлична от принятой нами (см. с. 173). Такие соотношения, использованные во многих исследованиях по кинетике действия ферментов, могут служить важным дополнительным источником информации при установлении характера доминирующего кинетического процесса. Однако, как и в случае соотношений Холдейна, прийти к однозначному выводу не всегда удается; так, соотношение, получаемое для упорядоченного механизма с образованием одного тройного комплекса, в условиях, обсуждавшихся в связи с уравнением (4.162), идентично соотношениям, характерным для механизма Теорелла — Чанса. Соотношения для трехсубстратных реакций приведены в работе [962].

11' Глава 4

Таблица 4.1

Соотношение Дальциля для двухсубстратных реакций

Кинетический механизм

Соотношение между кинетическими константами

Упорядоченный механизм с образованием тройного комплекса [уравнение (4.114)]

Механизм Теорелла — Чанса [уравнение (4.120)] км, е КА ^

Механизм двухстадийного переноса [уравнение (4.121)]

Неупорядоченный механизм в равновесных УСЛОВИЯХ при A*AM = A*AS И Л*вм=№ (с 135) лм е *А Vf

ж. Изотопный обмен

Важную информацию о кинетическом механизме реакции может дать исследование изотопного обмена. В ходе трансфе-разной реакции типа

АХ + В,=_ВХ + А, (4.163)

находящейся в равновесии, при наличии в системе радиоактивно меченого субстрата (или продукта) будет происходить включение радиоактивной метки в продукт (или субстрат) в результате многократного обращения реакции (см. гл. 8). Можно исследовать реакции обмена между АХ* и ВХ, А*Х и А, а также В*Х и В, но не между А* и В (звездочкой обозначено меченое соединение).

В наиболее простом случае метод изотопного обмена может использоваться для выяснения вопроса о том, какие компоненты необходимы для осуществления обменной реакции. Например, если фермент катализирует процесс двухстадийного переноса

Е + АХ ч=_ ЕАХ ЕХА *=fc ЕХ +А, (4.164)

ЕХ +В- ч=—= ЕХВ ^—^ ЕВХ ц—f Е + ВХ, (4.165)

то будет наблюдаться обмен между А*Х и А в отсутствие В и ВХ [уравнение (4.164)] и между В*Х и В в отсутствие А и АХ [уравнение (4.165)]. Если, однако, фермент функционирует по

Кинетика действия ферментов механизму, в котором для протекания реакции необходимо наличие обоих субстратов (например, в случае механизма Теорелла— Чанса или же механизма с образованием тройного комплекса), то реакции обмена будут осуществляться только в присутствии обоих субстратов. Использование обменных реакций этого типа с целью получения результатов качественного характера обсуждается более детально в гл. 8. Хотя такие исследования дают очень ценную информацию, следует соблюдать известную осторожность при интерпретации результатов, поскольку весьма возможно, что реакции, кинетически несущественные для протекания суммарной реакции, могут вносить большой вклад в обменную реакцию в конкретных условиях. Например, в случае механизма Теорелла —Чанса, обсуждавшегося на с. 143:

в

Е ц—*¦ ЕАХ ЕХА =р=± ЕХВ т—>- ЕВХ ^—*¦ Е, (4.166)

при условии, что комплекс ЕХА нестабилен, идет реакция

ЕХЛч=*ЕХ + А. (4.167)

Если скорость этой реакции невелика, то на кинетику суммарной реакции она существенно влиять не будет. При этом, однако, может происходить достаточно интенсивный обмен между А*Х и А:

Е + АХ т—*- ЕАХ <—*. ЕХА у.—>- ЕХ + А, (4.168)

если фермент инкубировать с этими реагентами в отсутствие В и ВХ. Необходимо, следовательно, убедиться в том, что наблюдаемый обмен характеризует основной, а не второстепенный кинетический путь, т. е. скорость наблюдаемого обмена должна быть достаточно велика, чтобы соответствующая стадия могла являться частью суммарной реакции.

Более детальные сведения о кинетическом механизме дает количественное исследование кинетики реакций изотопного обмена. Хотя эти реакции можно исследовать, определяя начальные скорости [563, 564], обычно их изучают в условиях, когда суммарная реакция находится в состоянии равновесия. Именно такой подход был впервые разработан Бойером [510, 515], и кинетика реакций изотопного обмена весьма детально проанализирована в ряде работ. Бойер [510], Олберти и др. [69], Мора-лес и др. [3233] и Флоссдорф и Кула [1380] вывели уравнение изотопного обмена для ряда двухсубстратных систем в стационарном приближении; Уонг и Хейнс [5150], а также Клеланд [802] показали, что для получения соответствующих уравнений может быть использован метод Кинга и Альтмана.

В обычно применяемом методе исследования кинетики обмена изменяют концентрации одного (немеченого) субстрата и Глава 4

одного (немеченого) продукта [например, АХ и А в уравнении (4.163)] так, чтобы их отношение оставалось постоянным (и равновесие суммарной химической реакции не нарушалось), и определяют влияние этого изменения на начальную скорость изотопного обмена между другим субстратом и другим продуктом. При увеличении концентрации пары субстрат — продукт могут наблюдаться два случая: скорость обмена либо непрерывно увеличивается, приближаясь асимптотически к максимуму, либо увеличивается только вначале, а затем при более высоких концентрациях снижается (рис. 4.28).

Уонг и Хейнс [5150] показали, что в общем случае можно предсказать ожидаемый результат для данного кинетического пути, не выводя полных кинетических уравнений. Они отмечают, что, если насыщение парой субстрат — продукт (концентрация которых изменяется) приводит к уменьшению концентрации двух «соседних» интермедиатов на пути обмена практически до нуля, будет наблюдаться ингибирование обмена. Например, изотопный обмен А*Х— А будет подавлен, если концентрация двух соседних интермедиатов, находящихся между «точками» включения АХ и А в реакционную последовательность, уменьшится практически до нуля, поскольку прервется путь, по которому может осуществляться обмен. Если, однако, насыщение парой субстрат — продукт приводит к значительному снижению концентрации только одного интермедиата, а концентрация одного из соседних интермедиатов остается конечной, обмен не прекращается, поскольку в этом случае (согласно принципу микроскопической обратимости) он может протекать при участии «соседнего» интермедиата.

В случае упорядоченной системы ах в

Е ЕАХ <—>- ЕАХВ <—> ЕАВХ ЕА <—*. Е (А. 169)

вх а \ • )

при увеличении концентраций В и ВХ концентрации ЕАХ, Е и ЕА уменьшаются, и фермент будет находиться преимущественно в составе комплексов ЕАХВ и ЕАВХ. При достаточно высоких концентрациях В и ВХ концентрации ЕАХ, Е и ЕА станут пренебрежимо малыми, и поскольку изотопный обмен между А*Х и А может осуществляться только при участии этих трех интермедиатов, он будет подавлен, как показывает кривая // на рис. 4.28. На самом деле для подавления обмена достаточно увеличения концентрации только В (или ВХ), приводящего к уменьшению концентрации двух соседних интермедиатов до нуля; поэтому обмен будет подавляться и при увеличении концентрации других пар субстрат — продукт, содержащих В или ВХ.

С другой стороны, обмен между В*Х и В в рассматриваемой системе не подавляется при повышении концентрации АХ и А,

Кинетика действия ферментов Рис. 4.28. Гипотетические кривые, показывающие влияние увеличения концентрации пары субстрат — продукт на начальную скорость изотопного обмена в системе, подчиняющейся уравнению (4.169). Кривая /, обмен В* — ВХ, изменяется концентрация АХ+А. Кривая //, обмен А*Х^А, изменяется концентрация ВХ+В.

О 5 Ю 15 ЮО

Концещррщия пары субстрат-продукт

приводящем к уменьшению до нуля концентрации только одного интермедиата (Е), но не ЕАХ или ЕА (см. кривую / на рис. 4.28). По тем же причинам другие пары, включающие АХ или А, также не способны подавлять обмен; концентрации некоторых интермедиатов могут при этом снижаться, однако они не находятся на прямом пути реакции обмена.

Если же продукты освобождаются в другой очередности, а именно:

ах в

Е ч—*¦ ЕАХ ЕАХВ <—*¦ ЕАВХ —> ЕВХ ч—>- Е, U 170)

а вх v • /

то насыщение компонентами АХ и А будет подавлять обмен между В*Х и В, поскольку концентрации двух соседних интермедиатов (ЕВХ и Е) уменьшатся практически д

страница 37
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Ферменты. Том 1" (3.77Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(18.07.2018)