Биологический каталог




Ферменты. Том 1

Автор М.Диксон, Э.Уэбб

ат А' будет выступать в роли ингибитора этой реакции. В случае неупорядоченного механизма в равновесных условиях возможны следующие пути реакции:

К:

ЕА кв

Е , ЕАВ---vE + P+Q

*//%KkA (4Л49>

ЕА' ^ЕА'В-----vE + P' + Q

Начальная скорость образования Р в равновесном приближении равна

v = -

1 +

•Км

1-К

А"м

+

ke

А"мБ

+

As Лм ab

(4.150)

Из этого следует, что если за ходом реакции следить по образованию Р, то А' будет конкурентным ингибитором по отношению к А и ингибитором смешанного типа по отношению к В. Если в систему вводится аналог В, наблюдается обратная ситуация.

Для фермента, который функционирует по упорядоченному механизму с образованием тройного комплекса (4.114), в приГлава 4

-сутствии альтернативного субстрата получаем следующую •схему:

*LO S.i k,.

ЕА ^ ЕАВ EPQ ч=—: ЕР ч==±= E

+i

k'

EA'

k' k' k'

+2 +3 +4 +5

EA'B a—* EP'Q ч=— ЕР' :?=_ E.

*'-» *'-4 *'-5

(4.151)

Эта ситуация аналогична рассмотренной выше, когда второй субстрат В усиливает ингибирующее действие А'. Уравнение начальной скорости образования Р в стационарном приближении имеет вид

v =-х-~-х-в-. (4.152)

l + ^-d + Q + ^+^^-^ + C)

где

С-( , ^(У-2 + ^)",У1 . , У-»*^ \

V k'-i *'+2*'+з& Д ^*'+4 (*'-. + *'«)/•

(4.153)

Таким образом, при постоянной концентрации В альтернативный субстрат А' будет проявлять себя как конкурентный ингибитор в отношении А, однако при наличии в системе А' график двойных обратных величин в координатах {1/6; l/v} при постоянной концентрации А не будет линейным.

Если в качестве альтернативного субстрата используется аналог В (В'), то систему можно представить в виде следующей схемы:

At, к Л At,

FAB;=- EPQ=± ЕР^± Е

к L*V/k ^ а-4 к 5

е^ьа ; (4.154)

ЕАВ ^ EPQ =е ЕР ^± Е

к к_4 к_5

В данном случае А не может усиливать ингибирующее действие В', поскольку связывается с ферментом раньше, чем В'.

Кинетика действия ферментов Уравнение скорости образования Q в стационарном приближении имеет вид

v~l+J^ + JbL(l + JL)+ «/«м»7^~Е| (4Л55)

' + а + Ь \1+Ki)+ ab V+Ki'J

где

K{=k'-x{k'-^k'^). (4.157)

« +2" +3

Следовательно, В' действует просто как конкурентный ингибитор по отношению к В и как ингибитор смешанного типа по отношению к А [см. табл. 4.5 (в)]. Необходимо отметить следующее обстоятельство: поскольку ингибитор В' является также и субстратом, то рассматриваемые константы ингибирования не являются истинными константами диссоциации, они представляют собой стационарные константы.

Если фермент функционирует по механизму Теорелла — Чанса, то в присутствии альтернативных субстратов применимы уравнения, справедливые для упорядоченного механизма; они имеют такую же форму, как (4.152) и (4.155).

В случае реакции двухстадийного переноса (4.121) при наличии субстрата, альтернативного А, имеем систему

EA^FP^E ^= Е В // ^ E^==±EQ, (4.158)

ЕА'^±Ь"Р^±Е"^±Е В

где Е' и Е" могут быть не идентичны. Поскольку в этом случае стадии освобождения продуктов (Р, Р' и Q) в условиях определения начальной скорости являются необратимыми, связывание В не будет оказывать прямого влияния на ингибироваиие, вызываемое А', в то же время А' будет выступать как конкурентный ингибитор по отношению к А и ингибитор смешанного типа по отношению к В. Если в качестве альтернативного субстрата будет взят аналог В, ситуация изменится на обратную.

Таким образом, использование альтернативных субстратов не позволяет различить неупорядоченный механизм в равновесных условиях и механизм двухстадийного переноса.

Этот подход дает, однако, возможность сделать выбор между неупорядоченным механизмом в равновесных условиях, с одной стороны, и упорядоченным механизмом Теорелла — Чанса— с другой. Кроме того, при этом можно установить, какой из субстратов связывается первым, если имеет место упорядоГлава 4

ю а 3 А Ч 15 -Б TAD* 129 тМ

s» 2 - TAD* j»129mkM 10 /б4,5тМ

; 1 1 64,5тМ 1 5 3*- ! —* I —" \ 1

О 2 4 6 0 1 2 3 4

NAD [Этанол]

Рис. 4.26. Использование альтернативных субстратов для установления механизма реакции, катализируемой алкогольдегидрогеназой печени [4022]. За ходом реакции следили по восстановлению NAD+. А. 3 мкМ этанол. Б. 2,48Х

XI 0-s М NAD+.

ченный механизм. На рис. 4.26 приведены графики двойных обратных величин, полученные для алкогольдегидрогеназы печени (КФ 1.1.1.1); в качестве альтернативных субстратов использовались NAD+ и тионикотинамидадениндииуклеотид (TAD+); за ходом реакции следили по образованию NADH. Приведенные данные говорят о том, что реакция протекает по упорядоченному механизму, в котором NAD (или его аналог) связывается с ферментом раньше, чем спирт [4022].

2. Определение суммарной скорости образования продуктов [1448]. Различить неупорядоченный и упорядоченный механизмы удается и в том случае, если регистрировать образование обоих альтернативных продуктов. Для системы, подобной (4.147) и (4.148), суммарная скорость образования обоих альтернативных продуктов (Р плюс Р') может быть определена также по скорости образования другого продукта (Q).

Для неупорядоченного механизма в равновесных условиях при наличии альтернативного субстрата (4.149) начальная суммарная скорость образования Р и Р' определяется уравнением

Из этого уравнения следует, что в случае определения суммарной скорости образования продуктов (в присутствии альтер-

Кинетика действия ферментов

Рис. 4.27. Использование альтернативных субстратов для установления механизма реакции, катализируемой дрожжевой гексокиназой [5303]. За ходом реакции следили по фосфорилированию смеси глюкоза+фруктоза. А. 219 мкМ глюкоза. 5. 444 мкМ АТР.

нативного субстрата) график двойных обратных величин будет нелинейным в координатах {1/а; l/v} (если альтернативный субстрат является аналогом А) и линейным в координатах {lib; Ijv). Если же в качестве альтернативного субстрата используется аналог В (В'), то имеет место обратная ситуация. На рис. 4.27 приведены результаты, полученные в опытах с дрожжевой гексокиназой (КФ 2.7.1.1); они согласуются со схемой, при которой субстраты — АТР и глюкоза — связываются с ферментом неупорядоченно. В качестве альтернативного субстрата для глюкозы была использована фруктоза; концентрация иона-активатора Мп2+ была насыщающей.

Если в случае упорядоченного механизма альтернативный субстрат связывается с ферментом вторым, например, в случае механизма Теорелла — Чанса

уравнение скорости образования Р (или Q плюс Q') в стационарном приближении имеет вид

V (4.161)

v —

1+ а -г ь + Ь' а )

где К'вм — истинная константа Михаэлиса для В плюс В'. Следовательно, графики двойных обратных величин в координатах

11—2277 Глава 4

{1/а; l/v) и {1/b; l/v) будут линейными. Если используется аналог субстрата, связывающегося первым, то получается уравнение, аналогичное (4.159); график двойных обратных величин в координатах {1/а, 1/и} будет нелинейным. Подобная ситуация характерна и для упорядоченного механизма с образованием тройного комплекса [схемы (4.151) и (4.154)].

д. Соотношения Холдейна

Соотношение Холдейна между константой равновесия и параметрами Михаэлиса для односубстратной реакции обсуждалось на с. 111—112. Олберти [62] показал, что для некоторых двухсубстратных реакций можно получить более одного соотношения Холдейна и что эти соотношения в определенных случаях являются специфическими для данного кинетического пути. Дальциль [956] суммировал соотношения Холдейна для

Таблица 4.7

Некоторые соотношения Холдейна для двухсубстратных реакций. Константа равновесия реакции обозначена через К; константы Михаэлиса (Кк) и кажущиеся константы диссоциации (Ks) для субстратов (А и В) и продуктов (Р и Q) имеют соответствующие

индексы

Кинетический механизм Соотношение Холдейна

Упорядоченный механизм с образованием тройного комплекса [уравнение (4.114)] ПКАКМ

Механизм Теорелла — Чанса [уравнение (4.120)] VbKAKl [ vb) кАмкм

Механизм двухстадийного переноса [уравнение (4.121)] к _ / Vf )

Неупорядоченный механизм в равновесных условиях [уравнение (4.134)] VbKAKm

Неупорядоченный механизм в равновесных условиях при KAn = Kas и KBx=KBs (с 135) VbKfKf

Кинетика действия ферментов обычных двухсубстратных реакций, а сравнительно недавно эти соотношения были получены для систем с числом субстратов больше двух [799, 962].

В табл. 4.7 представлены соотношения Холдейна для двухсубстратных реакций, рассмотренных в данной главе. Этот ряд соотношений безусловно не является исчерпывающим; более полная сводка приведена в работе Клеланда [799]. Соотношения Холдейна в ряде случаев помогли установить характер доминирующего кинетического пути. Например, Найгоорд и Тео-релл [3495] на основе соотношений Холдейна показали, что алкогольдегидрогеназа

страница 36
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Ферменты. Том 1" (3.77Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(20.11.2018)