|
|
Ферменты. Том 1ат А' будет выступать в роли ингибитора этой реакции. В случае неупорядоченного механизма в равновесных условиях возможны следующие пути реакции: К: ЕА кв Е , ЕАВ---vE + P+Q *//%KkA (4Л49> ЕА' ^ЕА'В-----vE + P' + Q Начальная скорость образования Р в равновесном приближении равна v = - 1 + •Км 1-К А"м + ke А"мБ + As Лм ab (4.150) Из этого следует, что если за ходом реакции следить по образованию Р, то А' будет конкурентным ингибитором по отношению к А и ингибитором смешанного типа по отношению к В. Если в систему вводится аналог В, наблюдается обратная ситуация. Для фермента, который функционирует по упорядоченному механизму с образованием тройного комплекса (4.114), в приГлава 4 -сутствии альтернативного субстрата получаем следующую •схему: *LO S.i k,. ЕА ^ ЕАВ EPQ ч=—: ЕР ч==±= E +i k' EA' k' k' k' +2 +3 +4 +5 EA'B a—* EP'Q ч=— ЕР' :?=_ E. *'-» *'-4 *'-5 (4.151) Эта ситуация аналогична рассмотренной выше, когда второй субстрат В усиливает ингибирующее действие А'. Уравнение начальной скорости образования Р в стационарном приближении имеет вид v =-х-~-х-в-. (4.152) l + ^-d + Q + ^+^^-^ + C) где С-( , ^(У-2 + ^)",У1 . , У-»*^ \ V k'-i *'+2*'+з& Д ^*'+4 (*'-. + *'«)/• (4.153) Таким образом, при постоянной концентрации В альтернативный субстрат А' будет проявлять себя как конкурентный ингибитор в отношении А, однако при наличии в системе А' график двойных обратных величин в координатах {1/6; l/v} при постоянной концентрации А не будет линейным. Если в качестве альтернативного субстрата используется аналог В (В'), то систему можно представить в виде следующей схемы: At, к Л At, FAB;=- EPQ=± ЕР^± Е к L*V/k ^ а-4 к 5 е^ьа ; (4.154) ЕАВ ^ EPQ =е ЕР ^± Е к к_4 к_5 В данном случае А не может усиливать ингибирующее действие В', поскольку связывается с ферментом раньше, чем В'. Кинетика действия ферментов Уравнение скорости образования Q в стационарном приближении имеет вид v~l+J^ + JbL(l + JL)+ «/«м»7^~Е| (4Л55) ' + а + Ь \1+Ki)+ ab V+Ki'J где K{=k'-x{k'-^k'^). (4.157) « +2" +3 Следовательно, В' действует просто как конкурентный ингибитор по отношению к В и как ингибитор смешанного типа по отношению к А [см. табл. 4.5 (в)]. Необходимо отметить следующее обстоятельство: поскольку ингибитор В' является также и субстратом, то рассматриваемые константы ингибирования не являются истинными константами диссоциации, они представляют собой стационарные константы. Если фермент функционирует по механизму Теорелла — Чанса, то в присутствии альтернативных субстратов применимы уравнения, справедливые для упорядоченного механизма; они имеют такую же форму, как (4.152) и (4.155). В случае реакции двухстадийного переноса (4.121) при наличии субстрата, альтернативного А, имеем систему EA^FP^E ^= Е В // ^ E^==±EQ, (4.158) ЕА'^±Ь"Р^±Е"^±Е В где Е' и Е" могут быть не идентичны. Поскольку в этом случае стадии освобождения продуктов (Р, Р' и Q) в условиях определения начальной скорости являются необратимыми, связывание В не будет оказывать прямого влияния на ингибироваиие, вызываемое А', в то же время А' будет выступать как конкурентный ингибитор по отношению к А и ингибитор смешанного типа по отношению к В. Если в качестве альтернативного субстрата будет взят аналог В, ситуация изменится на обратную. Таким образом, использование альтернативных субстратов не позволяет различить неупорядоченный механизм в равновесных условиях и механизм двухстадийного переноса. Этот подход дает, однако, возможность сделать выбор между неупорядоченным механизмом в равновесных условиях, с одной стороны, и упорядоченным механизмом Теорелла — Чанса— с другой. Кроме того, при этом можно установить, какой из субстратов связывается первым, если имеет место упорядоГлава 4 ю а 3 А Ч 15 -Б TAD* 129 тМ s» 2 - TAD* j»129mkM 10 /б4,5тМ ; 1 1 64,5тМ 1 5 3*- ! —* I —" \ 1 О 2 4 6 0 1 2 3 4 NAD [Этанол] Рис. 4.26. Использование альтернативных субстратов для установления механизма реакции, катализируемой алкогольдегидрогеназой печени [4022]. За ходом реакции следили по восстановлению NAD+. А. 3 мкМ этанол. Б. 2,48Х XI 0-s М NAD+. ченный механизм. На рис. 4.26 приведены графики двойных обратных величин, полученные для алкогольдегидрогеназы печени (КФ 1.1.1.1); в качестве альтернативных субстратов использовались NAD+ и тионикотинамидадениндииуклеотид (TAD+); за ходом реакции следили по образованию NADH. Приведенные данные говорят о том, что реакция протекает по упорядоченному механизму, в котором NAD (или его аналог) связывается с ферментом раньше, чем спирт [4022]. 2. Определение суммарной скорости образования продуктов [1448]. Различить неупорядоченный и упорядоченный механизмы удается и в том случае, если регистрировать образование обоих альтернативных продуктов. Для системы, подобной (4.147) и (4.148), суммарная скорость образования обоих альтернативных продуктов (Р плюс Р') может быть определена также по скорости образования другого продукта (Q). Для неупорядоченного механизма в равновесных условиях при наличии альтернативного субстрата (4.149) начальная суммарная скорость образования Р и Р' определяется уравнением Из этого уравнения следует, что в случае определения суммарной скорости образования продуктов (в присутствии альтер- Кинетика действия ферментов
Рис. 4.27. Использование альтернативных субстратов для установления механизма реакции, катализируемой дрожжевой гексокиназой [5303]. За ходом реакции следили по фосфорилированию смеси глюкоза+фруктоза. А. 219 мкМ глюкоза. 5. 444 мкМ АТР. нативного субстрата) график двойных обратных величин будет нелинейным в координатах {1/а; l/v} (если альтернативный субстрат является аналогом А) и линейным в координатах {lib; Ijv). Если же в качестве альтернативного субстрата используется аналог В (В'), то имеет место обратная ситуация. На рис. 4.27 приведены результаты, полученные в опытах с дрожжевой гексокиназой (КФ 2.7.1.1); они согласуются со схемой, при которой субстраты — АТР и глюкоза — связываются с ферментом неупорядоченно. В качестве альтернативного субстрата для глюкозы была использована фруктоза; концентрация иона-активатора Мп2+ была насыщающей. Если в случае упорядоченного механизма альтернативный субстрат связывается с ферментом вторым, например, в случае механизма Теорелла — Чанса
уравнение скорости образования Р (или Q плюс Q') в стационарном приближении имеет вид V (4.161) v — 1+ а -г ь + Ь' а ) где К'вм — истинная константа Михаэлиса для В плюс В'. Следовательно, графики двойных обратных величин в координатах 11—2277 Глава 4 {1/а; l/v) и {1/b; l/v) будут линейными. Если используется аналог субстрата, связывающегося первым, то получается уравнение, аналогичное (4.159); график двойных обратных величин в координатах {1/а, 1/и} будет нелинейным. Подобная ситуация характерна и для упорядоченного механизма с образованием тройного комплекса [схемы (4.151) и (4.154)]. д. Соотношения Холдейна Соотношение Холдейна между константой равновесия и параметрами Михаэлиса для односубстратной реакции обсуждалось на с. 111—112. Олберти [62] показал, что для некоторых двухсубстратных реакций можно получить более одного соотношения Холдейна и что эти соотношения в определенных случаях являются специфическими для данного кинетического пути. Дальциль [956] суммировал соотношения Холдейна для Таблица 4.7 Некоторые соотношения Холдейна для двухсубстратных реакций. Константа равновесия реакции обозначена через К; константы Михаэлиса (Кк) и кажущиеся константы диссоциации (Ks) для субстратов (А и В) и продуктов (Р и Q) имеют соответствующие индексы Кинетический механизм Соотношение Холдейна Упорядоченный механизм с образованием тройного комплекса [уравнение (4.114)] ПКАКМ Механизм Теорелла — Чанса [уравнение (4.120)] VbKAKl [ vb) кАмкм Механизм двухстадийного переноса [уравнение (4.121)] к _ / Vf ) Неупорядоченный механизм в равновесных условиях [уравнение (4.134)] VbKAKm Неупорядоченный механизм в равновесных условиях при KAn = Kas и KBx=KBs (с 135) VbKfKf Кинетика действия ферментов обычных двухсубстратных реакций, а сравнительно недавно эти соотношения были получены для систем с числом субстратов больше двух [799, 962]. В табл. 4.7 представлены соотношения Холдейна для двухсубстратных реакций, рассмотренных в данной главе. Этот ряд соотношений безусловно не является исчерпывающим; более полная сводка приведена в работе Клеланда [799]. Соотношения Холдейна в ряде случаев помогли установить характер доминирующего кинетического пути. Например, Найгоорд и Тео-релл [3495] на основе соотношений Холдейна показали, что алкогольдегидрогеназа |
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 |
Скачать книгу "Ферменты. Том 1" (3.77Mb) |
[каталог] [статьи] [доска объявлений] [обратная связь] |