Биологический каталог




Ферменты. Том 1

Автор М.Диксон, Э.Уэбб

ывание A (KsA=KAs-), KtQ = Kqi- (поскольку KsAKi'Q = KAs'KiQ; см. с. 135), и уравнение (4.137) упрощается до

у==—T^—f—л^ТТ-7П^- (4Л38)

Кинетика действия ферментов Из этого уравнения следует, что, как и ожидалось, Q является конкурентным ингибитором по отношению к В; в то же время наклон прямых, построенных в координатах {1/а; l/v), и длины отсекаемых ими отрезков при ненасыщающих концентрациях В увеличиваются в одно и то же число раз. Таким образом, эти прямые пересекаются с осью —l/s в точке —l/KsA (см. с. 130—133) и ингибироваиие является неконкурентным.

Если связывание Q влияет на связывание A (KsA#/CAs' и KiQ?=Ki'Q), применимо уравнение (4.137); наклоны прямых, построенных в указанных выше координатах, и длины отсекаемых отрезков увеличиваются по-разному, и, следовательно, будет наблюдаться смешанное ингибироваиие. Эта ситуация неотличима от механизма Теорелла — Чанса в случае ингибирования продуктом (см. табл. 4.6). Различить их можно с помощью другого подхода к использованию данных по ингибированию продуктом. Если справедлив механизм Теорелла — Чанса (4.133), величина Ki для Q, действующего как конкурентный ингибитор по отношению к А, является константой диссоциации комплекса EQ и, следовательно, не зависит от концентрации А. Однако в случае неупорядоченной системы (4.136) кажущаяся величина Ki для Q, действующего как конкурентный ингибитор по отношению к В, зависит от констант диссоциации Q из комплексов EQ и EAQ; если эти константы (Ktq и Ki'Q) не равны, кажущаяся константа Ki будет зависеть от концентрации А, стремясь к KiQ при очень малых а и к Ki'Q. при очень больших а. Этот подход был использован для того, чтобы показать, что креатинкиназа (КФ 2.7.3.2) функционирует по неупорядоченному механизму в равновесных условиях [3262].

Таким образом, результаты опытов по ингибированию продуктом вместе с данными первичных графиков теоретически позволяют сделать выбор между рассмотренными выше видами двухсубстратных реакций. Встречаются, однако, более сложные случаи. Если в рассматриваемых условиях реакция практически необратима или если один из продуктов нестабилен, не всегда удается провести исследование ингибирования продуктом. Кроме того, продукт может вести себя нетипично, связываясь не только с постулируемым компонентом, но и с другим интерме-диатом реакционной последовательности. Феномен связывания с ферментом двух молекул ингибитора обсуждается в гл. 8. Преодолеть эти трудности установления кинетического механизма часто помогают другие методы.

в. «Тупиковое» ингибироваиие

Чтобы установить, какой из возможных кинетических механизмов имеет место, в ряде случаев можно использовать ингибиторы фермента, которые не являются ни субстратами, ни проГлава 4

дуктами рассматриваемой реакции. Такие соединения взаимодействуют с ферментом, образуя абортивный или «тупиковый» комплекс (т. е. такой комплекс, который не находится на обычном пути реакции); этот комплекс в отличие от комплексов, образуемых ферментом с субстратами или продуктами, не способен к дальнейшим превращениям. Тип ингибирования, осуществляемого нереакционноспособными аналогами продуктов, во многих случаях подобен тому, который наблюдается под действием самого продукта, за исключением случаев, когда продукт вызывает обращение реакции. Так, для упорядоченной системы (4.114) аналог Q (О/) может быть неконкурентным ингибитором в отношении обоих субстратов, вызывая ингибирование типа (г) из числа рассмотренных в табл. 4.5.

Особый интерес представляет характер ингибирования, наблюдаемого в системах с двухстадийным переносом в присутствии аналогов продуктов; хотя аналоги не способны обратить стадию освобождения продукта, величина Л%А все же оказывается равной нулю (с. 140). Так, для случая, когда нереакци-онноспособный аналог Р (Р") связывается с модифицированной формой фермента (Е') согласно схеме (4.121), уравнение (4.95) принимает вид ч

(4.139)

где Ki — константа диссоциации комплекса ЕР". Для обратных величин имеем

и, следовательно, Р" будет конкурентным ингибитором по отношению к В и бесконкурентным по отношению к А (т. е. длины отрезков, отсекаемых прямыми, построенными в обратных координатах, увеличатся при наличии в системе Р", в то время как наклоны не изменятся). Аналог Q, напротив, окажется, скорее всего, конкурентным ингибитором по отношению к А и бесконкурентным по отношению к В.

Использование аналогов субстратов, которые связываются с ферментом, но не способны к дальнейшим превращениям, позволяет получить некоторые интересные типы ингибирования. Так, можно ожидать, что в упорядоченной системе (4.114) аналог А (А") будет связываться со свободным ферментом и вызывать ингибирование того же типа, что и Р — продукт, освобождающийся из комплекса с ферментом последним [табл. 4.5, случай (а)]. Аналог же В (В") будет вызывать ингибирование

Кинетика действия ферментов совершенно другого типа по сравнению с тем, которое вызывает продукт Q. Схему (4.114) можно представить в виде ЕАВ"

*-Jf|*+

ЕА -г—?- ЕАВ <—* EPQ =j==fc ЕР i—>- Е. (4.141)

Действие В" проявляется в понижении концентрации комплекса ЕА и, следовательно, в уменьшении скорости превращения ЕА обратно в свободный фермент. При этом кажущаяся константа диссоциации ЕА при 6 = 0 (KsA) уменьшится в (l + b"/r\i) раз, где Ki— константа диссоциации, равная &_ю/&~но (см. гл. 8). Кроме того, если В" связывается с той же самой формой фермента и с тем же участком, что и В, он будет конкурентным по отношению к этому субстрату, увеличивая Квм в {\ + b"IKi) раз; таким образом, ингибирующее действие В" при очень высоких Ь становится пренебрежимо малым, так как В вытесняет его из комплекса с ферментом. Поскольку Ккш является по определению концентрацией А, при которой скорость равна половине максимальной в условиях насыщающей концентрации В, то эта константа не изменяется в присутствии В". Таким образом, уравнение (4.86) принимает вид

V

Ь"

I ?~ аЬ\

1+ а + Ь \ + Ki )+ ab

(4.142)

и, как можно заметить, В" выступает в роли конкурентного ингибитора по отношению к В и бесконкурентного — по отношению к А, если только концентрация В не является насыщающей; в этом случае, конечно, ингибирования не наблюдается.

Если с ферментом, функционирующим по упорядоченному механизму, связывается аналог первого субстрата (А"), то он может и не препятствовать связыванию второго субстрата; в результате возможно образование тройного тупикового комплекса:

ЕА" ЕА"В

*if| (4.143) Е т—У ЕА т-+ ЕАВ <—У EPQ ч—* ЕР <—>- Е. Глава 4

Здесь В будет не только выступать в роли субстрата, но и усиливать ингибирование, вызываемое А". Уравнение скорости для этой системы имеет вид

______V_

1+ a [1+KiKiB + «t)+ b + <*> \+Ki)

(4.144)

где Ki и KiB — константы диссоциации А" из комплекса ЕА" и В из комплекса ЕА"В соответственно, а К" — более сложная константа. Из этого уравнения следует, что график двойных обратных величин в координатах {1/6; l/v} становится нелинейным в присутствии А", в то время как в координатах {1/а; l/v} остается линейным.

То же самое наблюдается и для системы Теорелла — Чанса [уравнение (4.120)], если связывание аналога А" не исключает образования тупикового комплекса ЕА"В. Однако при образовании тупикового комплекса в неупорядоченной равновесной системе

ЕА

Е ЕАВ--->Е(- Продукты

4%V» (4Л45>

EA'^ihA В

возникает ситуация, совершенно аналогичная той, которая описывается схемой (4.136); соответствующее уравнение имеет такой же вид, как (4.137):

1 +

КьлА 4

KSA Лмв

ab а

(4.146)

график двойных обратных величин является линейным, а влияние ингибитора рассмотрено на с. 152. Таким образом, при образовании тупиковых тройных комплексов нелинейность графика двойных обратных величин позволяет различать неупорядоченные и упорядоченные системы; к последним относятся, в частности, системы Теорелла — Чанса. При этом можно также установить, какой субстрат связывается с ферментом первым.

Как и в случае ингибирования аналогами продуктов, возможен ряд других путей взаимодействия аналогов субстратов с ферментом, приводящих к ингибированию; следовательно, хотя

Кинетика действия ферментов использование таких аналогов может способствовать подтверждению данного кинетического механизма, получаемые результаты следует трактовать с известной осторожностью.

г. Альтернативные субстраты

Как показал Фромм [1448, 4022, 5303], информацию о доминирующем кинетическом пути могут дать опыты по использованию альтернативного субстрата. В этом случае в систему с ферментом, катализирующим двухсубстратную реакцию, вводят два разных первых (или вторых) субстрата наряду со вторым субстратом, так что одновременно могут протекать две реакции:

А + В—> P + Q, (4.147) А' + В-*P' + Q. (4.148)

Эту систему можно исследовать двумя путями.

1. Определение скорости образования одного из альтернативных продуктов [4022]. При определении образования Р в системе (4.147) альтернативный субстр

страница 35
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Ферменты. Том 1" (3.77Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(19.10.2018)