Биологический каталог




Ферменты. Том 1

Автор М.Диксон, Э.Уэбб

ыми Ц' величинами, зависящими от нескольких констант скоростей. ? Было показано, что по упорядоченному механизму функциони-"Л рует ряд ферментов, в том числе несколько дегидрогеназ; при

* этом коферменты связываются с ферментом раньше, чем субст-f раты [3835, 4650].

f Связывание одного или обоих субстратов в ходе реакции •4. (4.114) может быть равновесным процессом. Если это условие > будет выполняться, например, в отношении субстрата А, т. е. скорость стадии ЕА+В—>-ЕАВ будет меньше, чем скорость рас* Глава 4

пада ЕА на свободный фермент и А, то комплекс ЕА будет находиться в равновесии со свободными Е и А. В этом случае в отличие от неупорядоченного механизма в равновесных условиях связывание субстрата происходит на медленной стадии и скорость этой стадии, следовательно, зависит от концентрации В. Таким образом, может существовать система, в которой связывание А при низкой концентрации В происходит в равновесных условиях, а при более высоких концентрациях эта стадия становится стационарной. Теоретически прн бесконечном увеличении Ь система переходит в стационарные условия, однако практически в рабочем интервале концентраций субстрата нередко оказывается возможным анализировать упорядоченные системы в рамках равновесного приближения.

В этих условиях кажущаяся константа КАм. может становиться пренебрежимо малой, поскольку при насыщающих концентрациях В равновесие E-f-A^tEA полностью сместится в сторону образования ЕА при условии, что содержание А не меньше, чем фермента. Величина КАк будет стремиться к е/2 (если использовать при расчетах суммарную концентрацию А, а не концентрацию свободной формы этого субстрата); если концентрация фермента очень мала, как это обычно имеет место, член КАк/а будет пренебрежимо малым и уравнение (4.86) упростится до

и=-jt-^-j-г. (4.115)

1 + аЬ

В предположении о равновесном связывании обоих субстратов аналогичные рассуждения приводят для последовательности реакций

А

Е + А ЕА,

ЕА + В ЕАВ, (4.116)

ЕАВ ->- Е-f Продукты

к уравнению, идентичному (4.115) (см. с. 134—135).

Обратную форму уравнения (4.115) можно преобразовать к виду

Следовательно, графики зависимости l/v от 1/а при различных концентрациях В образуют семейство пересекающихся прямых, подобно тому, как это было для других рассмотренных выше

Кинетика действия ферментов

систем, однако в данном случае точка пересечения будет всегда лежать выше оси \/а. Наклоны прямых равны KsAKnB/Vb. Таким образом, вторичный график зависимости наклонов этих прямых от 1/Ь будет прямой с наклоном Ks^KnP/V, проходящей через начало координат (длина отсекаемого отрезка равна нулю).

Преобразуя уравнение (4.115) для построения первичных графиков зависимости l/v от 1/Ь, получаем

44*«-+-^^Rx+t-- (4л18)

В данном случае первичные графики при различных концентрациях А образуют семейство прямых, которые пересекаются в точке, лежащей на оси l/v. Эти результаты не следует рассматривать как свидетельство в пользу того, что при насыщающей концентрации В реакция может достичь максимальной скорости в отсутствие А; они показывают только, что необходимая для этого концентрация А мала.

Первичные графики рассмотренного типа и вторичный график, проходящий через начало координат, характерны для упорядоченного механизма, в котором стадия связывания первого субстрата является равновесной; при этом можно установить, какой субстрат связывается первым.

Подобные соотношения часто встречаются в системах, в которых компонент, связывающийся первым, является не субстратом, а активатором, причем активатор все время остается связанным с ферментом:

Е ч—*¦¦ ЕА ч—*¦. ЕАВ 1—*¦ ЕАР. (4 Ц9)

f t|

Анализ такой системы показывает, что активатор А может связываться равновесным образом, при этом в отличие от упорядоченных равновесных систем равновесие сохраняется при Ь, стремящемся к бесконечности. Иногда подобным образом функционируют металлы-активаторы [пируваткарбоксилаза (КФ 6.4.1.1), лактозосинтаза (КФ 2.4.1.22)] {3259].

26. Упорядоченные системы с пренебрежимо малыми стационарными концентрациями тройных комплексов (механизмы Теорелла — Чанса)

Механизмы такого типа были впервые рассмотрены Теорел-лом и Чансом [4709] для объяснения кинетики действия пече* ночной алкогольдегидрогеназы, поэтому их часто называют Глава 4

\

механизмами Теорелла — Чанса. Процесс может быть представлен в виде следующей схемы:

а в

Е 5F=fc ЕА ЕР Е. (4.120)

Предполагается, что скорость образования тройного комплекса ЕАВ столь мала, а скорость распада столь велика, что его концентрация для кинетики процесса несущественна. Анализ такой системы в предположении стационарности снова приводит к уравнению, идентичному уравнению (4.86). К числу ферментов, функционирующих по механизму Теорелла — Чанса, относятся лактатдегидрогеназа (КФ 1.1.1.27) [5302] и альдегид-дегидро-геназа (КФ 1.2.1.3) [1172] из мышц кролика.

2в. Упорядоченные системы без образования тройных комплексов

В таких системах реакция протекает путем образования ряда двойных комплексов, причем в одном из промежуточных состояний фермент связан не с субстратом, а с переносимой группой, как показано на рис. 4.22, верхняя цепь реакций. Система может быть представлена как две реакционные последовательности

Е *=±. ЕА ¦* Е'Р ч=ь Е' + Р,

(4.121)

. Е' ч—»- Е'В ч=±= EQ ч—Е + Q,

связанные между собой через Е' (фермент, ковалентно связанный с группой, удаляемой от А в ходе первой стадии и присоединяющейся к В на второй).

Если рассматривать начальные скорости, когда концентрации продуктов равны нулю, то стадия Е'Р—»-Е'+Р является необратимой, и система, следовательно, сводится к случаю, представленному на с. 134, когда кажущаяся константа диссоциации для связывания А с ферментом (KsA) равна нулю. Поэтому общее уравнение (4.86) упрощается до (4.95).

Уравнение, обратное (4.95), имеет вид

ts=jti4+(1+j^)t- <4л22>

•и, следовательно, графики двойных обратных величин для каждого из субстратов (при ряде фиксированных концентраций другого субстрата) образуют семейство параллельных прямых. Константы можно определить с помощью вторичных графиков зависимости длин отсекаемых от оси l/v отрезков от 1/а или 1/Ь, как показано в табл. 4.2.

Кинетика действия ферментов Таблица 4.2

Графики двойных обратных величин для систем, подчиняющихся уравнению 4.95

График

Наклон

Отрезок, отсекаемый от осн

I/o

Отрезок, отсекаемый от оси

1/s

Первичный график: зависимость l/v от 1/а

Вторичный график: зависимость длины отрезка, отсекаемого от оси 1/а, от 1/&

к-

м

К

м

1 +

К

м

К

м

Первичный график: зависимость 1/а от 1/6

Вторичный график: зависимость длины отрезка, отсекаемого от оси 1/а, от 1/а

м

К,

м

К

м

1 +

К

м

К

м

/С,

м

Слейтер [4319] отметил, что для систем, подчиняющихся уравнению (4.95), график зависимости найденных величин /См от V является для каждого из субстратов прямой, проходящей через начало координат.

Если реакция исследуется при ряде фиксированных концентраций продукта, кажущаяся константа диссоциации для взаимодействия фермента с А не будет равна нулю, система будет описываться уравнением (4.86), и графики двойных обратных величин для каждого из субстратов образуют семейства пересекающихся прямых.

Системы, представленные схемой (4.121), характерны для ряда ферментов, в том числе для аминоксидазы (флавинсодер-жащей) (КФ 1.4.3.4), у которой свободная модифицированная форма фермента содержит связанный восстановленный флавин [2061, 2062, 4748], и для гидроксиметилглутарил-СоА — синта-зы из дрожжей (КФ 4.1.3.5) [3151]. Эти системы называют системами с двухстадийным переносом, механизмом двойного замещения или пинг-понг-механизмсм. Глава 4

I

i

Установление кинетического механизма

а. Использование первичных графиков

Большинству рассмотренных двухсубстратных систем, для которых графики двойных обратных величин линейны, отвечают близкие по виду семейства первичных графиков (при ряде фиксированных концентраций одного из субстратов); исключение составляют реакции двухстадийного переноса и упорядоченные равновесные системы, у которых первичные графики образуют семейство параллельных прямых. Если, однако, первичные графики параллельны, это еще не означает, что фермент функционирует по механизму двухстадийного переноса. Иногда истинный механизм двухстадийного переноса трудно отличить экспериментально от случая, для которого KsAKM.B/ab [см. (4.86)] очень мало. Так, хотя первичные графики для ферментов 6-фосфофруктокиназы (КФ 2.7.1.11) [2083] и оксидазы D-амияокислот [2575] образуют семейство параллельных прямых, по данным, полученным другими методами, эти ферменты функционируют не по механизму двухстадийного переноса. Один из путей для решения вопроса о том, какой из механизмов имеет место — истинный двухстадийный перенос или же механизм, от

страница 32
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Ферменты. Том 1" (3.77Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(19.10.2018)