Биологический каталог




Ферменты. Том 1

Автор М.Диксон, Э.Уэбб

>первым взаимодействует с ферментом (имеется в виду механизм с упорядоченным присоединением субстратов), т. е. для субстрата, который связывается со свободным ферментом, точка пересечения соответствует 1//СА Это позволяет определить истинную величину сродства фермента к А, однако при этом необходимо знать, какой из двух субстратов первым взаимодействует с ферментом; другими словами, нужно иметь независимый метод обнаружения взаимодействия одного из субстратов со свободным ферментом. На рис. 4.24 представлены данные, полученные для трех дегидрогеназ, о которых известно, что они связываются с NADH в отсутствие других субстратов. Величины Ks для NADH, полученные из этих графиков, достаточно хорошо согласуются со значениями констант диссоциации, определенными физическими методами.

9'

Таблица 4.1

Графики двойных обратных величии для двухсубстратных систем, описываемых уравнением (4.86)

График Наклон Отрезок, отсекаемый от оси 1/р Отрезок, отсекаемый от оси 1/s Точка пересечения

Первичный график: зависимость 1/у от 1/а Вторичные графики: зависимость длины отрезка, отсекаемого от оси l/v, от 1/6 зависимость наклона от 1/6

Первичный график: зависимость 1/и от 1/6 Вторичные графики: зависимость длины отрезка, отсекаемого от оси 1/у, от 1/а зависимость наклона от 1/а Кинетика действия ферментов

Рис. 4 24. Метод Фридена для определения сродства фермента к первому присоединяющемуся суб-сграту [1417] А Лактатдегидроге-наза Б. Алкогольдегидрогеназа печени. В. Дрожжевая алкогольдегидрогеназа.

Следует отметить, что получаемая величина Ks не обязательно является истинной константой связывания для реакции Е+'А^ЕА, поскольку в том случае, когда комплекс ЕА подвергается какой-либо трансформации до связывания В, например

в

Е + А -у-* ЕА (ЕА)» т—*- ЕАВ, (4.93)

все стадии, происходящие до связывания В, вносят вклад в кажущуюся константу диссоциации.

Константы в уравнении общего вида (4.86) зависят от природы доминирующего пути реакции. Так, если после взаимодействия с А может происходить необратимое превращение (до связывания В), например

Е + А з—>- ЕА -> (ЕЛ)» ч=> ЕАВ, (4.94)

то величина кажущейся константы диссоциации для А будет равна нулю. Следовательно, член KsАКкв/иЬ будет отсутствовать Глава 4

и общее уравнение упростится до

о=-^-g-. (4.95)

1 I Км I Км 1+ а "г Ь

Это упрощение важно для определенных кинетических механизмов.

Рассмотрим возможные механизмы двухсубстратных реакций.

1а. Неупорядоченный равновесный механизм

Этот механизм может быть представлен следующей схемой:

ЕА=<=* k

-ЕАВ -»- Е +Продукты, (4.96)

Е —

ЕВ

где стадия, характеризующаяся константой k, является лимитирующей. Такие системы были первоначально проанализированы Холдейном [1749]; см. также [4372]. Для четырех равновесных реакций

Е + А^=±ЕА, (9.97)

E + B^=fcEB, (4.98)

ЕА + В ЕАВ, (4.99)

ЕВ -f A 5=fc ЕАВ, (4.100) получаем четыре уравнения:

{e—xa—xb — x)a=KtKxa, (4.101)

{е-ха-хь-х)Ь=К* х„, (4.102)

хаЬ=Кш*х, (4.103)

xba=KuAx, (4.104)

где а, Ь, х, ха, Хъ — концентрации соответственно А, В, ЕАВ, ЕА и ЕВ; KsA, KsB, КмА, Кмв — константы диссоциации четырех равновесных реакций. Скорость суммарной реакции пропорциональна концентрации ЕАВ. Таким образом,

v=kx. (4.105)

Исключая х из приведенных выше уравнений, получаем

ke ,л 1л^ч

Кинетика действия ферментов Это уравнение, идентичное (4.86), содержит только три из четырех констант равновесия. Четвертая оказывается «излишней», так как она связана с остальными тремя константами соотношением

^А/Смв=/СмА^В- (4.107)

Исходя из соображений, приведенных на с. 96—97, можно показать, что член ke равен максимальной скорости. При выводе уравнения (4.106) не было сделано допущения о влиянии, которое может оказывать взаимодействие фермента с одним из субстратов на взаимодействие с другим. Кинетические константы, входящие в это уравнение, могут быть получены таким же путем, как это было сделано выше на с. 129—131.

Если каждый субстрат взаимодействует только со своим собственным участком связывания и не оказывает влияния на сродство фермента к) другому субстрату, то KsA=KnA и Ksb=Km.b', уравнение (4.106) при этом упрощается до

/С/ KgB KSA KSB ( KsA\i /CSB V

В этом случае первичные графики, полученные для одного из субстратов (при ряде фиксированных концентраций другого), образуют семейство прямых, точка пересечения которых лежит на оси абсцисс 1/s. Таким образом, обе константы Михаэлиса можно определить просто путем изменения концентрации одного из субстратов при постоянной концентрации другого.

Многие ферменты переноса, например креатинкиназа (КФ 2.7.3.2) [2620, 3262] и карнитин-ацетилтрансфераза (КФ 2.3.1.7) [749], функционируют по неупорядоченному равновесному механизму.

16. Неупорядоченный стационарный механизм

Уравнение (4.82), выведенное для рассматриваемой системы в предположении стационарности, значительно сложнее, чем уравнение (4.86). Оно сходно с уравнением для стационарной системы с неконкурентным ингибированием и ингибированием смешанного типа (гл. 8).

Уравнение (4.82) содержит члены, зависящие от концентрации обоих субстратов и продукта, у —скорость, считающаяся положительной для реакции в прямом направлении (ведущей к образованию Z; см. рис. 4.20). Для начальных скоростей пряГлава 4

мой или обратной реакции это выражение можно упростить путем подстановки либо 2 = 0, либо а=Ь = 0. В первом случае

=_(ciflft + с2а*Ь + csab*) е_ „ ^

vf r7+c8a + c9& + c10afe + c11a2-г-с12&2+с13а2&+с14оА2 ' к' >

а во втором

Последнее уравнение имеет такой же вид, как и уравнение Бриггса — Холдейна (4.16), но выражения для V и Км более сложные, а именно:

у _ сАе _ (k-ik-ik-nk-s + k-xk-Jt-jk-d е (4 111)

% _ _?7__ fe-1fe-2fe-3 + fe-1fe-2fe_4 -f fe-xfe-^ss ,д ,, n\

С другой стороны, уравнение (4.109) для скорости прямой реакции не может быть сведено к виду (4.16) (для любого из субстратов), так как даже если а или Ь является постоянным, в уравнении остаются члены, содержащие Ь2 или а2. Если Ь постоянно, получаем

„ — №" + /а)с /4 11^

Vf—k + la* + ma' (- ^

где

1=сф,

1=сф-\-с3Ь2,

1г = с7 + с9Ь-\-с12Ь*,

т=с8 + С10Ь-\-спЬ*.

Эта. система названа Уонгом и Хейнсом системой второй степени относительно а, поскольку субстрат А взаимодействует с двумя разными формами фермента. В таком случае система не может анализироваться с использованием «константы Михаэлиса» и график обратных величин не является линейным. Такое аномальное поведение может быть обусловлено рядом причин. Первая, как в данном случае, — это наличие параллельных путей превращения субстрата, связанное с образованием фермент-субстратного комплекса в неупорядоченном механизме двумя путями; например, в данном случае субстрат А связывается как с Е, так и с ЕВ. Если один из этих путей исключается, например если й+4=0, коэффициенты при членах, содержащих а2, становятся равными нулю и получается уравнение Михаэлиса обыч-

I

Кинетика действия ферментов ного вида. Вторая причина состоит в том, что фермент катализирует реакцию, в которой участвуют две идентичные молекулы субстрата, причем обе они входят в состав тройного комплекса (см. с. 171). И наконец, еще одна возможная причина отклонения от линейности — кооперативные свойства фермента (гл. 8).

Степень отклонения графика двойных обратных величин от линейности для неупорядоченных стационарных систем зависит от соотношения между константами скоростей и концентрациями обоих субстратов. Петтерсон [3666, 3667] провел детальное теоретическое исследование неупорядоченных стационарных систем и показал, что в области относительно низких концентраций субстрата график Лайнуивера — Бэрка линеен. Уравнения, описывающие эти линейные участки, подобны тем, которые были приведены в предыдущем разделе для равновесной * системы; в рассматриваемых условиях стационарную систему можно анализировать таким же образом, как равновесную. Гулбинский и Клеланд [1707] показали, что фермент галакто-киназа (КФ 2.7.1.6) из Е. coli функционирует по неупорядоченному стационарному механизму, при этом, однако, график двойных обратных величин и характер ингибирования продуктом такие же, как если бы имели место равновесные условия. Используя для анализа неупорядоченного двухсубстратного механизма ЭВМ, эти исследователи показали также, что иногда графики двойных обратных величин (для начальных скоростей) не сильно отклоняются от линейности, даже если равновесное приближение неприменимо.

Ж

Д.'

2а. Упорядоченные системы, в которых образуется тройной комплекс

Последовательность стадий в этом случае можно представить в виде

Е ^—у ЕА * ЕАВ ъ-г-* EPQ т-> ЕР я—*¦ Е. (4.114)

* Анализ этой системы в предположении стационарности приво-дит к уравнению, идентичному (4.86), однако в данном случае

i КАгл и Квгл являются не константами равновесия, а сложн

страница 31
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Ферменты. Том 1" (3.77Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(10.12.2018)