Биологический каталог




Ферменты. Том 1

Автор М.Диксон, Э.Уэбб

величине Vi, вероятно, определяются в основном ошибкой в определении V2, поскольку Vt можно определить с удовлетворительной точностью. Таким образом, условия для точного определения каждой из констант и для максимального проявления двухфазности не совпадают.

Приведенные выше данные показывают, что путем экстраполяции нельзя получить надежные результаты; Спеарс, Снейд и Лотен [4412] предложили подход, основанный на методе последовательных приближений, который позволяет весьма точно охарактеризовать параметры уравнения Михаэлиса.

Нерастворимые субстраты

Обычно ферментативные реакции протекают в растворе. Когда количество добавленного субстрата превышает предел его растворимости, то избыток субстрата не участвует в реакции. Если растворимость субстрата не слишком велика при сопоставлении ее с константой Михаэлиса, то скорость реакции будет определяться уравнением Михаэлиса только до достижения предела растворимости; при дальнейшем добавлении субстрата скорость увеличиваться не будет. Величина V [уравнение (4.11)] никогда не будет достигнута, так как концентрация субстрата, которая насыщает водный раствор, будет недостаточГлава 4

Рис. 4.18. Зависимость скорости гидролиза от концентрации субстрата при действии карбоксилэсте-разы [5011]. /—гидролиз этилбу-тирата; II — гидролиз трибутири-на. Вертикальная пунктирная прямая указывает предел раствори-

мости трибутирина. 1,0-Ю~гМ

ной для насыщения фермента. На рис. 4.18 приведены результаты типичного опыта с карбоксилэстеразой печени (КФ 3.1.1.1), гидролизующей этилбутират и трибутирин. Весь добавленный этилбутират находился в растворенном состоянии. Трибутирин, который относительно мало растворим, добавляли в виде эмульсии; достигаемая при этом конечная концентрация показана на графике. В области слева от пунктирной прямой (см. график) трибутирин полностью растворялся и образовывал прозрачный водный раствор; в области справа растворялась только часть эмульсии, и концентрация трибутирина в растворе была предположительно постоянна.

Сарда и Дэсньюэл [4071] показали, что панкреатическая липаза (КФ 3.1.1.3) не действует на растворенные субстраты; она активна только при адсорбции на поверхности раздела фаз гид-ролизуемый эфир — вода (очевидно, вследствие того, что только в этом случае обнажается ее активный центр). При работе с очень малорастворимым субстратом, например триолеином, применяемым в виде эмульсии, получают типичную кривую Михаэлиса, исходящую из начала координат. В то же время с более растворимым субстратом, например метилбутиратом, не обнаруживается активности в области полного его растворения, т. е. слева от пунктирной прямой; кривая Михаэлиса исходит в этом случае из точки, в которой водная фаза оказывается насыщенной эфиром (рис. 4.19). Таким образом, получается картина, полностью противоположная той, которая представлена на рис. 4.18 для карбоксилэстеразы.

Если между свободным и адсорбированным ферментом устанавливается равновесие, то по положению кривой может быть определена «константа Михаэлиса», которая представляет собой константу диссоциации комплекса фермент — поверхность раздела. Вместо концентрации субстрата, как в обычной теории, в выражение для константы входит площадь поверхности разде-

Кинетика действия ферментов 1»ис. 4.19. Зависимость скорости гидролиза от концентрации субстрата (метилбутират) при действии панкреатической липазы [4071]. Скорость выражена в процентах от максимальной скорости, определяемой в опытах по гидролизу триолеина; концентрация отнесена к концентрации насыщенного раствора, принятой за 1,0.

ла; она зависит от степени эмульгирования, а также от количества присутствующего субстрата. Сарда и Дэсньюэл выражают свои результаты в форме константы Михаэлиса, определяемой как молярная поверхностная концентрация при скорости реакции, равной половине максимальной. Под молярной поверхностной концентрацией понимается площадь всех поверхностей раздела в одном литре эмульсии, деленная на площадь поверхности, занимаемой одним молем субстрата. Поскольку число молекул фермента, способных одновременно взаимодействовать с 1 см2 поверхности раздела, определяется главным образом тем, какую площадь занимает одна молекула фермента, а не площадью, приходящейся на одну молекулу субстрата (ибо эта последняя имеет значительно меньшие размеры), то, вероятно, лучше пользоваться реальной величиной площади поверхности раздела.

Кинетические уравнения для ферментов, действующих на два и большее число субстратов

Общие методы получения уравнений для стационарных условий

Для ферментативной реакции с определенной последовательностью стадий можно составить систему совместных уравнений. Согласно одному из них, сумма концентраций всех форм фермента остается постоянной, согласно другим (одно уравнение для каждого ферментного комплекса)—концентрация соответствующего комплекса остается постоянной в стационарных условиях; в эти последние уравнения входят константы скорости всех тех превращений, в которых участвует рассматриваемый

Е 4

06-

Площадь поверхности роздела

0 200 400 см2/мл Растворяется Не растворяется

—О—Ь—

О 0,5 1,0 1,5 20

Общая концентрация метилбути'.'. а Глава 4

ЕА

Рис. 4.20. Схема реакций для ферментной системы, рассматриваемой на рис. 4.21. Суммарная реакция: A+B^Z.

комплекс. В некоторых случаях эту систему уравнений можно решить обычными методами, как это было сделано для простой системы, рассмотренной на с. ПО—111, и найти выражение для концентрации интересующего нас промежуточного комплекса, аналогичное уравнению (4.15); умножение полученной величины на константу скорости распада этого комплекса даст значение скорости суммарной реакции.

Для ряда частных случаев путем прямого расчета были получены соответствующие уравнения; две наиболее ранние сводки по этому вопросу составлены Сегалом, Кахмаром и Бойером [4182] в 1952 г. и Ингрехемом и Маковером [2139] в 1954 г.; дальнейшую разработку вопроса провели Дальциль [956], Олберти [64], Клеланд [799], Плоумэн [3701], а также Бэкер и Малер [252].

Кинг и Альтман [2458] для решения рассмотренной выше системы уравнений применили метод детерминантов и на основании полученных результатов сформулировали ряд важных правил, которые позволяют найти выражение для скорости реакции без утомительного вычисления значений отдельных детерминантов. Метод лучше всего рассмотреть и проанализировать на конкретном примере. Будет рассмотрен случай, когда фермент катализирует реакцию между двумя субстратами А и В с образованием продукта Z; в ходе реакции в результате последовательного взаимодействия А и В в случайном порядке с ферментом образуется тройной комплекс (который мы обозначим EXY). Схема реакций с константами скорости и промежуточными комплексами приведена на рис. 4.20. Это один из нескольких примеров, рассмотренных Уонгом и Хейнсом [5149] на основе метода Кинга и Альтмана.

Этот метод заключается в составлении комбинаций стрелок, отражающих переходы между различными состояниями фермента; комбинации составляются в соответствии с определенными правилами, и каждая из них отвечает определенному члену в уравнении скорости суммарной реакции. Для получения членов числителя строят все возможные комбинации стрелок, которые удовлетворяют следующим требованиям:

Кинетика действия ферментов а) от каждого ферментсодержащего комплекса (включая сам свободный фермент) отходит одна стрелка (не более);

б) стрелки не должны образовывать замкнутого цикла;

в) изображается только одно направление данной стадии.

Следует напомнить, что первым и последним элементом схемы на рис. 4.20 является свободный фермент. Для схемы, приведенной на рис. 4.20, имеется восемь возможных комбинаций стрелок (они показаны на рис. 4.21), удовлетворяющих приведенным выше требованиям для членов числителя. Каждой комбинации отвечает произведение соответствующих констант скорости. Половина членов числителя относится к прямой реакции, половина — к обратной. Члены, относящиеся к прямой реакции,, положительны, и в них входит концентрация субстрата. Члены, относящиеся к обратной реакции, отрицательны, и в них входит концентрация продукта.

Члены знаменателя получают, составляя по схеме рис. 4.20 все возможные нециклические комбинации стрелок, содержащие на одну стрелку меньше, чем для числителя. При этом должны выполняться те же самые требования, за исключением того, что на схеме всегда имеется одна форма, от которой не отходит стрелка. Комбинации стрелок для знаменателя также приведены на рис. 4.21. Под каждой комбинацией стрелок показан соответствующий член, входящий в уравнение скорости.

Так получают уравнение скорости реакции для обратимой системы, показанной на рис. 4.20:

__(схаЬ -f- c2a2b -f- c3ab2 — c^z — сьаг — сфг) e_

~~ c^f^o7fc^+c^ab~^

(4.82)

где

*"2 = ^+1^+3^+4^+5» C3 = k+2k+sk+ik+&,

Ci =&_1&_2&_з^-5 "T" ^-1^-2^-4^-5» Ce = &_2&+з&-4^-5!

C7 = &_j&_2&_3 -f- &_f&_2^-4 "f" &-i&-2^-+5>

^8 = &+l

страница 29
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Ферменты. Том 1" (3.77Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(18.11.2018)