Биологический каталог




Ферменты. Том 1

Автор М.Диксон, Э.Уэбб

ерментами. В одном из таких случаев скорость гидролиза бензоилхолина препаратом холинэстеразы из сыворотки лошади [4550] выражалась величиной 440 мкл-ч-1, скорость гидролиза изоамилацетата — 131 мкл-ч-1, а смесь этих двух субстратов гидролизовалась со скоростью 314 мкл-ч-1. Если бы гидролиз осуществлялся двумя разными ферментами, скорость его должна была бы равняться сумме скоростей гидролиза отдельных субстратов, а именно 571 мкл-ч-1. На основании же приведенных выше данных было сделано заключение, что гидролиз ряда холиновых и других эфиров осуществляется одним и тем же ферментом.

Тот же метод можно использовать и как количественный, если известны относительные концентрации аир этих субстратов (т. е. если известны константы Михаэлиса) [5012]. Если оба субстрата атакуются одним и тем же ферментом, то из уравнения (4.63)

Когда присутствует только один из субстратов, то

(4.70)

Vb— l + p •

Подставляя (4.71) и (4.72) в (4.70), получаем

(4.72)

vt--1 + а+р • (4,/d'

Если субстраты присутствуют в равных относительных концентрациях, а = р=о, то

vt = (va + vb).±tJL.1 (4.74)

Кинетика действия ферментов Рис. 4 16. Латентный период, обусловленный наличием примесей в субстрате [5108]. Гидролиз этилового эфира миндальной кислоты карбоксилэстеразой печени. / — 0,008 М редистиллированного субстрата; // — 0,016 М редистиллированного субстрата; III — 0,008 М перекристаллизованиого субстрата.

Время, мин

Следовательно, скорость превращения смеси субстратов падает от значения, равного сумме скоростей превращения каждого из субстратов (в отсутствие второго) для случая, когда а очень мало, до 3U этой суммы при сг=72> до 2/з прис=1 и до 7г, когда а очень велико.

Хотя метод смешанных субстратов обычно является весьма эффективным способом обнаружения двух ферментов с разными значениями V, в одном частном случае наличие двух ферментов выявить не удается. Это происходит тогда, когда субстрат первого фермента одновременно является конкурентным ингибитором второго фермента и при этом Kt для второго фермента близка к /См для первого фермента (и наоборот). Подобную ситуацию рассматривали Хоуслей и Типтон [206Q] при исследовании флавинсодержащей аминоксидазы (КФ 1.4.3.4).

Интересное явление наблюдается в том случае, когда субстрат содержит в виде загрязняющей примеси небольшое количество другого субстрата, обладающего значительно большим сродством к ферменту и в то же время гидролизующегося со значительно меньшей максимальной скоростью, чем испытуемый субстрат. Подобный случай был описан Вилыптеттером [5108] при изучении гидролиза редистиллированного этилового эфира миндальной кислоты карбоксилэстеразой печени (КФ 3.1.1.1). Субстрат содержал небольшие количества соответствующего кетоэфира, который обладал очень высоким сродством к ферменту, но медленно им расщеплялся. Благодаря высокому сродству кетоэфир почти полностью вытеснял основной субстрат из комплекса с ферментом и, действуя как конкурентный ингибитор, снижал наблюдаемую скорость реакции почти до нуля. При этом, однако, кетоэфир подвергался медленному, но непрерывному гидролизу, и, когда после завершения его гидГлава 4

ролиза основной субстрат получал, наконец, доступ к ферменту, скорость гидролиза основного субстрата резко увеличивалась, как показано на рис. 4.16. Таким образом, в этом случае наблюдался длительный латентный период, продолжительность которого была пропорциональна количеству взятого субстрата (и, следовательно, количеству загрязняющей примеси). После латентного периода начиналась нормальная реакция, при которой количество образовавшейся кислоты линейно зависит от времени. Если же эфир подвергали очистке путем перекристаллизации, латентного периода не наблюдалось.

Два фермента, действующие на один субстрат

Превращение субстрата может катализироваться одновременно двумя или большим числом ферментов.

Рассмотрим действие двух ферментов, которые мы обозначим индексами 1 и 2; полная скорость превращения субстрата будет равна сумме скоростей двух отдельных реакций

"'-tv+tiv- (4-75)

1+ s 1 + ~

откуда . , Ki + K* КгК2 1+ s s2

(4.76)

Форма кривой, описываемой этим уравнением, будет зависеть от соотношения величин К\ и Къ. Если К\~К2, то кривая превращается в прямую, как в случае действия одного фермента (рис. 4.17, А, кривая I). Длины отрезков, отсекаемых этой прямой на осях координат, равны в этом случае l/(Vi + V2) и —1/К\( = — 1/Л2). Если константы К\ и К2 различаются, то зависимость не будет линейной и результаты будет трудно интерпретировать. Ряд теоретических кривых, полученных по уравнению (4.76) и изображенных на рис. 4.17, Л, показывает влияние изменения К2 на форму кривых при V\ = V2—l и постоянном К\ = 10~3] кривые, изображенные! на рис. 4.17,5, показывают влияние изменений Vi и V2 при постоянных К\ и К2, равных соответственно 10~3 и Ю-4.

Все кривые представляют собой гиперболы с двумя ветвями. У каждой гиперболы часть одной из ее двух ветвей и вся вторая ветвь целиком не описывают никакого реального процесса, так как им соответствуют отрицательные значения концентрации субстрата. Две ветви гиперболы пересекают ось абсцисс соответственно в точках —1/Д"2 и —1/Ки в чем можно легко убедиться при анализе уравнения (4.76).

Кинетика действия ферментов i /НжГ

Рнс. 4.17. Гидролиз одного субстрата двумя ферментами. Теоретические кривые, построенные по уравнению (4.76). А. 1^= у2=1, /Ci=10-S М. / — К2=Ю_3; Я-К2=4-10-4; /// —/С2=1,5.10-<; IV— /Сг= Ю-*. Б. Ki = W~s М, /С2= = 10-* М. /— Vi = l, V8-l; II— V\=5, F2=l; ///—F, = l, F2=5. Глава 4

Если концентрация субстрата достаточно низка, то все рассмотренные выше кривые приближаются к прямым, пересекающим ось абсцисс в точке —I//C2. Этого и следует ожидать, так как при очень низких концентрациях субстрата только фермент с большим сродством к субстрату будет оказывать существенное влияние на скорость реакции.

Для всех представленных кривых предполагается, что K\>Ki. По мере уменьшения величины 1/s кривые изгибаются, потому что, как было указано выше, их воображаемые продолжения должны пересечь ось абсцисс в точке —1//G. В некоторых случаях, например для условий, соответствующих кривой IV на рис. 4.17, Л и кривой /// на рис. 4.17,5, этим изгибом можно на практике пренебречь. Если при этом рассматривать систему как одноферментную и через точки, рассчитанные но уравнению, провести прямую, то будет найдена величина Км — промежуточная между К\ и Кг.

В работах ряда авторов [1105, 3885, 4462] отмечено, что при определении величин /См и V путем экстраполяции линейных участков графиков двойных обратных величин могут иметь место большие ошибки; отношение градиентов при l/s=0 и l/s = oo является мерой отклонения графика от линейности; это отношение (г) определяется выражением

. /477

Для линейного графика (кривизна равна нулю) г будет равно единице, а г—1—нулю. Для данных К\ и К2 кривизна будет максимальна при V\ = V2. Поскольку выражение (4.77) симметрично по отношению к V\ и V2, уменьшение кривизны в случае, когда один из ферментов является относительно более активным, не зависит от того, какой именно из ферментов более активен. Как отмечалось выше, степень кривизны зависит также от отношения величин /См, и оно должно быть достаточно велико, чтобы можно было обнаружить двухфазность; так, например, при отношении величин Ki и К2, равном 5, крутизна графика изменяется только в 2 раза.

Как видно из рис. 4.17, очень трудно экстраполировать график в области 1/s—М), поскольку увеличение кривизны определяется выражением d2(l/t>)/d(1/s)2, которое увеличивается при 1/s—И). На практике это приводит к тому, что в случае больших /См их значения, полученные путем экстраполяции, оказываются заниженными. С другой стороны, в случае малых Км экстраполяция графика в области больших значений 1/s приводит лишь к небольшому занижению величины Км; при этом, однако, для получения достаточно точных данных необходимо определить скорости при s^K2. Кажущиеся значения Км и V,

Кинетика действия ферментов определяемые по точкам пересечения касательных при l/s=0 и l/s=oo с осью —1/s, вычисляются с помощью выражений (4.78) —(4.81) [4462]:

А1,каж —-V! + V2-' (4-'°)

А2,каж— V2 + (K22/K12)V1 ' ( >

у _ [V, + (*./*i) У Л2 (л Ш

К2-каж V2 + (K22IKi*) Vi ' к '

^.каж = ^-^.каж. (4-81)

где Vt — суммарная максимальная скорость, определяемая по точке пересечения гиперболы с осью l/v.

Очевидно, что достаточно точно определить Ki трудно. Если К\~Ж2 и Vi = V2, то определяемая величина будет приблизительно в два раза меньше истинной, в то же время при Ki^>K2 и V2^>Vi график зависимости обратных величин не будет иметь кривизны. Определение /G оказывается, очевидно, более точным при Ki^>K2 и V2^>Vi, но весьма надежные данные получаются также при Ki/K2 = l0 и V\ = V2. Величина V2 определяется менее надежно, чем К2, поскольку выражение в числителе возводится в квадрат; эта величина более точна при Ki^>K2 и V2^VX. Ошибки в

страница 28
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Ферменты. Том 1" (3.77Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(18.11.2018)