Биологический каталог




Ферменты. Том 1

Автор М.Диксон, Э.Уэбб

идин—ам-миак-лиаза (К.Ф. 4.3.1 3). Ход реакции определяли по образованию NH3 в течение трех интервалов времени при различных начальных концентрациях субстрата.

Интегрируя, получаем

П=Г07-+/М fr^H-XMln-^. (4.28) о

Уравнение такою вида было предложено в 1902 г. Анри [1905]. При условии, что другие неучитываемые факторы не оказывают влияния, это уравнение может быть использовано для определения Км и V по данным измерений, полученным в ходе реакции, если не удается определить начальную скорость реакции. Преобразуя (4.28), получаем

t s0— у Км /См t v '

Таким образом, если измерить у через определенные проме-

, 2,303 , s0

жутки времени и построить график зависимости —-{— lg^ _^

от у It, то мы получим прямую с наклоном —1/Км, отсекающую на оси абсцисс отрезок, длина которого соответствует V. Ту же самую прямую можно получить по данным измерений, произведенных через определенный промежуток времени после начала реакции, но при разных so. Поэтому на одном и том же графике могут быть представлены данные измерений для различных t и so. На рис. 4.14 приведены изображенные по этому методу [4947] результаты серии опытов с гистидин — аммиак-лиазой (КФ 4.3.1.3).

Как и исходное уравнение Михаэлиса, уравнение (4.28) существенно упрощается, когда s0 становится либо очень большим, либо очень малым. Если so очень велико по сравнению с у я с Км, то мы имеем уравнение Vt—y, которое соответствует харак-

Кинетика действия ферментов теризующемуся постоянной скоростью начальному участку нулевого порядка кривой хода реакции при высокой концентрации субстрата. Если s0 (а следовательно, и у) очень мало по сравнению с Км, мы получаем обычное уравнение реакции первого порядка

^|2Lig_5i_=_V (4.30) ' so — У Am

Для каждого данного эксперимента величина V/Км постоянна. Таким образом, при очень низкой концентрации субстрата реакция описывается уравнением первого порядка с константой скорости V/Км- Определить V и Км по отдельности, конечно, не представляется возможным, поэтому специфичность ферментов нельзя выражать через константы скорости реакций первого порядка, полученные в опытах с различными веществами, поскольку этот способ ие дает ответа на вопрос о том, какая константа изменяется.

Уравнение (4.30) применимо только при определенных условиях. Чтобы убедиться в том, что измерения проводятся именно в таких условиях, следует построить график зависимости

lg—-— от t (см. [1231]). Если уравнение применимо, получа-so — У

ется прямая и могут быть использованы константы реакции первого порядка; если же наблюдается заметное отклонение от линейности, необходимо использовать уравнение (4.29).

Уравнение (4.29) непосредственно применимо только к необратимым реакциям, поскольку обратимая реакция прекращается не по исчерпании субстрата, а вследствие достижения равновесия. Олберти [66] показал, что для простой односубстрат-ной реакции

k k

Е + S ES =*=^= E + Продукт (4.31)

можно использовать интегральное уравнение стационарной кинетики, чтобы найти все четыре константы скорости, если известна концентрация продукта для равновесных условий. Однако сомнительно, чтобы какая-либо реакция соответствовала столь простой схеме. Дарвей и Уильяме [971] развили анализ, проведенный Олберти, и рассмотрели реакцию типа (4.33); они получили также интегральные уравнения для некоторых двух-субстратных реакций в стационарном приближении. Эти вопросы обсуждаются в работе [3551а].

Интегральные уравнения не нашли, однако, широкого применения; во многих случаях графики, характеризующие течение реакции, оказывались слишком сложными для анализа. Использование интегральных уравнений в случае стационарных уелоГлава 4

вий подверглось критике в работе [4851], и их следует рассматривать скорее как предмет теоретических изысканий, а не как метод анализа экспериментальных данных.

Селвин [4195] отметил, что поскольку V является функцией концентрации фермента е, то

et=f(y). (4.32)

Следовательно, концентрация продукта у определяется произведением концентрации фермента на время. Если получить серию кривых хода реакций при различных концентрациях фермента и построить графики зависимости у от et, то точки для различных концентраций фермента лягут на одну кривую (рис. 4.15,Л). Если, однако, фермент нестабилен и подвергается денатурации в ходе реакции, то уравнение (4.32) оказывается неприменимым, поскольку концентрация активного фермента зависит от времени. В этом случае точки для разных (начальных) концентраций фермента попадут на разные кривые, как показано на рис. 4.15, Б. Такой график, следовательно, является простым тестом для обнаружения возможной денатурации фермента в ходе реакции, хотя подобные отклонения могут быть обусловлены и другими причинами, в том числе несовершенством метода определения (с. 87—88).

et v et

Рис. 4.15. А. Графики хода АТРазной реакции; по оси абсцисс отложено произведение времени на количество фермента. Условия определения: 2,5 мМ АТР, 2,5 мМ MgS04, 50 мМ Трис-HCl (рН 7,4), общий объем 10 мл, температура 25°. Объем добавленного раствора фермента: А — 0,5 мл, О—1,0 мл, ? — 2,0 мл. 5. Графики, построенные в предположении, что уменьшение скорости обусловлено мономолекулярной реакцией денатурации. - график,

построенный по экспериментальным точкам рис. А (О);---графики, построенные по предыдущему: нижний — для 0,5 мл добавленного фермента,

верхний — для 2,0 мл.

Кинетика действия ферментов В случае некоторых регуляторных ферментов график хода реакции может быть очень сложным. Ряд таких примеров был проанализирован Фриденом [1422, 1424]; они обсуждаются в гл. 8.

Применимость допущения о стационарности

Гипотеза о том, что концентрация фермент-субстратного комплекса остается практически постоянной во время измерения начальной скорости ферментативной реакции, была подвергнута математическому анализу в ряде работ [1872, 2018, 4974, 4975, 5144]. Как будет показано позже в разделе об измерении скоростей быстрых реакций (с. 260 и далее), говоря о начальной скорости, имеют в виду линейный участок кривой хода реакции, а не обычно очень короткий предстационарный период, в течение которого концентрации фермент-субстратных интермедиатов увеличиваются. При обсуждении техники регистрации быстрых реакций будет также показано, что в условиях, когда концентрация фермента представляет собой величину того же порядка, что и концентрация субстрата, достигаемое стационарное состояние является обычно преходящим. Эти эмпирические наблюдения получили математическое обоснование в работах Уолтера и Моралеса [4975] и Уолтера [4974], которые показали, что предположение о стационарности может привести к относительно большим ошибкам, если бимолекулярная константа скорости для прямой реакции невелика по сравнению с константой скорости обратной реакции, т. е. в ситуации, наиболее вероятной при сравнительно небольшой величине отношения концентраций субстрата и фермента. Однако в условиях, когда eСистемы с несколькими последовательными стадиями

Даже если в реакции участвует только один субстрат, механизм реакции может включать более чем один промежуточный комплекс. При этом уравнение скорости реакции будет содержать больше констант скорости, чем простое уравнение Бриггса — Холдейна, хотя вид его не изменится. Соответствующее уравнение скорости и, следовательно, выражения для V и Ки Для реакции с определенным числом промежуточных комплексов могут быть получены либо алгебраическим путем, либо с помощью метода, рассмотренного ниже. Прямое алге-

по

Глава 4

браическое решение осуществляется следующим образом. Для обратимой системы с двумя интермедиатами

E + S 4=*: ES ЕР *s=fc Е + Р (4.33)

*-i *-2 *-з

можно записать следующие выражения для изменения концентраций ES(x) и ЕР (у) во времени, которые для стационарных условий равны нулю:

JfL=fc+1s(e_х—y) + k_2y—(?_,+ k+2) x=Q, (4.34)

=k.3p(e—x—y)-\-k+zx—(k+3+ k_%) y=Q, (4.35)

где s и p — концентрации субстрата и продукта соответственно. Если определить начальную скорость прямой реакции в отсутствие продукта, то члены, содержащие р в уравнении (4.35), будут равны нулю.

Выражение для скорости прямой реакции (vf) можно записать в следующем виде:

vf*=k+2x—k_2y. (4.36)

Поскольку, однако, стадия освобождения продукта, характеризующаяся константой k+з, необратима (при р=0), проще использовать для расчета скорости выражение

vf=k+3y. (4.37)

Уравнение (4.35), в котором все члены, содержащие р, опущены, можно преобразовать к виду

х=у *+з + 6-2 (4 38)

+2

и подставить в (4.34), исключив тем самым х. Далее, произведя подстановку в уравнение (4.37), находим

k+2 + k-2 + k+

страница 26
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Ферменты. Том 1" (3.77Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(10.12.2018)