Биологический каталог




Ферменты. Том 1

Автор М.Диксон, Э.Уэбб

t, хотя s=?st. При этом наблюдается только смещение вправо точек пересечения с У-прямой, расстояния же между ними не изменяются, так что определяемые величины Км остаются достоверными (см. рис. 4.32). Величина смещения характеризует молярную концентрацию фермента, определяющую отклонение s от st. Легко показать, что, когда концентрация фермента мала и s = st, расстояние первой точки пересечения от оси v равно Км, однако при достаточно большом количестве фермента оно равно et + Км, как показано на рис. 4.32.

Другие преимущества этого метода (наряду с отсутствием ограничений для применения) заключается в том, что в нем используются несколько точек графика, а не одна, как в методе /, и что подобный подход может быть применен для определения Ki ингибиторов (см. ниже). Метод имеет особенно важное значение при исследовании ферментов с высоким сродством к субстратам или ингибиторам, которые должны использоваться в очень низких концентрациях — часто столь же низких, как концентрация фермента. Более того, как показано на рис. 4.33, оказывается возможным определять концентрации компонентов системы для любой точки кривой. Как ограничение метода можно рассматривать то обстоятельство, что для определения Км (но не К) необходимо найти V, однако какие-либо ошибки в установлении положения У-прямой автоматически выявляются по отсутствию равенства расстояний между точками пересечения.

Другой графический метод, сходный с методом 6 и впервые использованный Шварценбахом и др. [4161] для расчета констант диссоциации, недавно применен Эйзенталем и Корниш-Боуденом [1221], а также де Мигель Мерино [1050] для определения Км- От других методов он отличается тем, что не пре-

Кинетика действия ферментов_103

Рис. 4.13. Определение Км и V.

дусматривает построения графика по экспериментальным точкам. Как показано на рис. 4.13, координаты точек, т. е. величины s и v, откладывают на горизонтальной и вертикальной осях соответственно и через каждую пару точек проводят прямую. Следует подчеркнуть, что эти прямые не являются графиками, как в случаях 3 и 4, — каждая из них проведена для одной экспериментальной точки; они соответствуют секущим в методе 6.

Все прямые должны пересекаться в точке с координатами {•Км; V}. Это легко объяснить, принимая во внимание, что согласно уравнению (4.18), треугольники, образуемые прямыми и отсекаемыми ими на осях отрезками, подобны треугольникам, образуемым этими прямыми, осью s и пунктирной Км-пря-мой. Для первых отношение высоты к основанию равно vfs, а для вторых V/(Km + s), что удовлетворяет уравнению (4.18). Для каждой отдельной прямой это положение справедливо в любой точке, и правильным является такое значение V, при котором для всех прямых получается одна и та же величина Км, т. е. это значение соответствует ординате точки пересечения, подобно тому как в методе б при правильном значении V получают одну и ту же величину Км Для всех отрезков. Близкое сходство между двумя рассматриваемыми методами можно выявить, совершая параллельный перенос прямых рис. 4.12,?' влево до тех пор, пока точки пересечения не совпадут с первой точкой,— тогда мы получим рис. 4.13!

Этот метод достаточно прост и не занимает много времени; если не все прямые пересекаются строго в одной точке, то оп< тимальное значение Км получают по среднему значению [886]. Метод, однако, не очень удобен, когда на одном чертеже необходимо представить данные двух или более экспериментов. Поскольку наибольшая точность достигается, когда прямые пересекают осн под углом около 45°, метод в известной мере мало чувствителен к отклонениям от «гиперболичности» (в смысле соответствия графику Михаэлиса) при очень больших или очень малых концентрациях субстрата. Вероятно, главным его недостатком по сравнению с методом 6 является то, что он Глава 4

применим лишь в случае, если s = st, поскольку это предположение заложено в уравнении, на котором данный метод основан. Кроме того, неясно, каким образом с помощью этого метода можно определять Kt ингибиторов или концентрации компонентов системы, когда et и St являются величинами одного порядка. Метод же 6 позволяет это сделать.

Помимо описанных выше графических предложен ряд статистических методов, в которых кинетические данные анализируют либо с помощью уравнения Михаэлиса — Ментен, либо используя обратную форму этого уравнения. Эти методы позволяют анализировать кинетические данные с привлечением ЭВМ ц дают возможность оценить достоверность определяемых кинетических констант. Статистические методы оказываются особенно полезными тогда, когда имеется большое число данных i[2120] и когда при анализе кинетических данных используют сложные уравнения скорости [801]. Такие методы описаны рядом авторов [800, 2238, 5095], и для них детально разработана соответствующая программа на фортране [801].

В связи с использованием ЭВМ для определения кинетических констант нельзя не подчеркнуть, что прежде чем проводить сложные исследования, кинетические данные следует проанализировать обычными методами. Если разброс данных слишком велик, не удастся достичь успеха и при дальнейшем анализе. Так, если результаты не удовлетворяют простому уравнению Михаэлиса, попытки анализировать их с помощью какого-либо другого основывающегося на нем уравнения приведут к ошибочным результатам; если какой-либо участок графика двойных обратных величин является явно нелинейным (например, вследствие ингибирования высокими концентрациями субстрата), он должен быть исключен из рассмотрения до того, как данные будут использованы для анализа с помощью простого уравнения Михаэлиса. Применение ЭВМ является весьма заманчивым, но может привести к неверным выводам относительно правильности интерпретации. Очевидно, однако, что компьютерный анализ позволяет провести расчеты с необходимой точностью; это особенно важно, если нужно установить, пересекается ли семейство прямых на одной из осей (см. с. 145 и далее). В то же время возможность получения с помощью ЭВМ правильного ответа зависит от точности экспериментальных данных; если необходимо обнаружить тонкое различие — установить, например, тип ингибирования (смешанное или бесконкурентное) — то необходимо располагать данными параллельных определений, с тем чтобы можно было оценить величины стандартных ошибок.

Как указывалось на с. 97, до тех пор, пока sКинетика действия ферментов га показатель V/Км можно считать кажущейся константой скорости первого порядка для взаимодействия субстрата с ферментом. Ошибка, допускаемая при таком определении величины V/Км, будет зависеть от относительной концентрации субстрата; если s составляет 1% Км, ошибка будет меньше 1%, в то же время, если s составляет 10% Км, она составит 9°/о- В случае ферментов, которые характеризуются очень большими величинами Км, может оказаться затруднительным (из-за ограниченной растворимости субстрата) использовать достаточно большой диапазон s для анализа данных обычным путем. В таких случаях отношение V/Км можно все же приблизительно определить по участку кривой v—s, подчиняющемуся зависимости псевдопервого порядка; такой подход был использован при исследовании ряда протеолитических ферментов [1520, 2877].

Как отмечалось в гл. 2, график хода ферментативной реакции часто является нелинейным. Использование такой кривой для кинетического анализа в общем случае весьма затруднительно, поскольку на скорость реакции могут влиять многочисленные факторы, поэтому до сих пор рассмаривались начальные скорости. Однако в частном случае, когда уменьшение скорости реакции обусловлено исключительно уменьшением насыщения фермента вследствие снижения концентрации субстрата, график хода реакции может содержать достаточно информации для определения Км и V.

Наиболее простой путь анализа такой кривой — это построение нескольких касательных к ней, характеризующих скорость реакции при соответствующих концентрациях (остающегося) субстрата. Такой подход был использован при исследовании кинетики ряда ферментов [2312, 4164], он, конечно, ограничен системами, для которых продукты реакции не являются ингибиторами. Балком и Фитч [256] показали, что кривую для ферментативной реакции, продукт которой является ингибитором, можно описать с помощью уравнения Михаэлиса, если ввести член, который отражает вклад ингибирования данным продуктом. Необходимо, однако, знать тип ингибирования, вызываемого продуктом (см. гл. 8), а это можно достоверно установить только по данным определения начальных скоростей,

Альтернативный подход заключается в анализе графика хо^ да реакции с помощью интегральной формы уравнения Михаэлиса.

Если s0 — начальная концентрация субстрата, a s0—у— концентрация в момент времени t, то скорость в этот момент времени будет определяться выражением

Км. + *о — У'

(4.27) Глава 4

Рис. 4.14. Использование уравнения Михаэлиса в интегральной форме для определения V и Км [4947]. Фермент — гист

страница 25
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Ферменты. Том 1" (3.77Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(11.12.2018)