Биологический каталог




Ферменты. Том 1

Автор М.Диксон, Э.Уэбб

й формой, смещая равновесие в пользу активной формы, в то время как цитрат связывается с неактивной формой. АТР может связываться с обеими формами фермента, поэтому наблюдается более сложная картина; однако при высоких концентрациях АТР, по-видимому, способствует диссоциации. Подобные системы рассматриваются более подробно в гл. 8.

2. Выпуклые кривые v — [Е]

Графики зависимости скорости от концентрации фермента выходят в этом случае на плато, т. е. достигается кажущаяся предельная скорость (рис. 4.6). Такое отклонение от линейности встречается чаще, чем описанное выше, и может быть объяснено несколькими причинами,

а. Несовершенство метода определения, а не истинное снижение активности фермента,

В тех случаях, когда определение активности данного фермента предусматривает добавление второго фермента, активность последнего может лимитировать скорость изучаемой реакции, в результате чего будет наблюдаться кривая, подобная кривой / на рис. 4.6. При увеличении количества второго фермента скорость будет увеличиваться и мы получим картину, представленную кривой //. Те же самые рассуждения применимы к системе, содержащей несколько ферментов, если в этой системе количество одного фермента изменяется, а количество

?8

Глава 4

V

О

Рис. 4 6. Ограничение скорости реакции условиями измерения. Объяснение см. в тексте.

о [е;

других ферментов остается постоянным. До тех пор пока количество определяемого фермента будет относительно невелико, так что другие ферменты будут иметься в избытке, общая скорость процесса будет пропорциональна концентрации определяемого фермента; если же его концентрация станет достаточно большой, скорость начнет лимитироваться концентрацией других ферментов. Таким образом, каталитическая эффективность фермента (определяемая, например, его молекулярной активностью) будет постоянной до тех пор, пока другие ферменты будут находиться в избытке, но начнет падать при более высоких концентрациях, когда лимитирующим становится количество одного из других ферментов.

Кривые, подобные приведенным на рис. 4.6, часто встречаются при манометрических измерениях, если роль лимитирующего фактора чграет скорость диффузии газа в жидкость; поэтому скорость реакции может быть определена манометрическим методом только в известных пределах. Прн спектрофото-метрическом измерении скорости исходная оптическая плотность раствора при высоких концентрациях фермента может оказаться столь большой, что результаты регистрации дальнейшего увеличения плотности окажутся некорректными. При этом результаты измерений зависят от оптических характеристик монохроматора, и кажущийся максимум скорости будет, следовательно, зависеть от типа используемого спектрофотометра. Применение методов регистрации активности протеолитических ферментов, которые основаны на определении суммарного ко-

Кинетика действия ферментов Рис. 4.7. Влияние очень высокой концентрации фермента на скорость процесса в сложной ферментной системе [4527]. Система Лактат + Лактатдегидрогераза (К.Ф. 1.1.1.27)+МАО++флаво-протенд (К-Ф. 1.6 4 3)+Метнлено-вый синий+Ог

личества всех продуктов гидролиза белка, не осаждаемых три-хлоруксусной кислотой или другими подобными реагентами, также может приводить к нелинейности. «Допущение, согласно которому увеличение небелкового азота пропорционально числу гидролизованных пептидных связей, по-видимому, не имеет достаточного основания. Количество освободившегося небелкового азота определяется положением гидролизов а вшейся пептидной связи в молекуле белка, а также природой продуктов расщепления» [2145].

Другие тривиальные причины, которые могут влиять на активность фермента и которые следует устранить, — это изменение рН среды, обусловленное добавлением больших количеств фермента, или изменение ионной силы. Последний эффект особенно важен в тех случаях, когда ионная сила исходного раствора фермента высока.

б. Как уже упоминалось в гл. 3, если в распоряжении исследователя имеегся чистый фермент, то становится возможным добавлять его к изучаемой системе в относительно очень большом количестве. Если при этом фермент обладает значительным сродством к одному из компонентов системы, например к коферменту, то практически весь кофермент может оказаться связанным данным ферментом, и в результате кофермент станет недоступным для других ферментов рассматриваемой системы. В этом случае с увеличением концентрации фермента скорость сложной ферментативной реакции будет уменьшаться. Примером этого может служить лактатдегидрогеназная система. Штрауб [4527] показал, что если существенно увеличивать концентрацию лактатдегидрогеназы (КФ 1.1.1 27) в условиях постоянной и притом небольшой концентрации NAD+ и значительной концентрации флавопротеида [дигидролипоамид-дегид-рогеназы (NADP+), КФ 1 64 3], то ход реакции будет харак-

ZoffiJ Глава 4 Рис, 4.8. Влияние ингибитора, присутствующего в препарате фермента, на скорость реакции [5011]. Фермент — арилсульфатаза (К-Ф. 3.1.6.1). Ферментный препарат — нерчнщенный экстракт печени. / — недиализованный экстракт; // — 0,2

0,4

И, мл

0,6

0,8

диализованный экстракт.

теризоваться кривой, приведенной на рис. 4.7. На этом графике концентрация фермента для удобства отложена в логарифмическом масштабе. Чем выше концентрация дегидрогеназы, тем ниже концентрация свободного кофермента. Связывание кофер-мента при высоких концентрациях дегидрогеназы не дает ему возможности реагировать с флавопротеидом и вызывает значительное снижение скорости суммарной реакции.

в. Кривая, подобная изображенной на рис. 4.6, может получаться в тех случаях, когда определяют не начальную скорость, а изменения, происходящие в результате реакции за определенный период времени, как показано на рис. 2.2.Б. Подобный результат вызывается исчерпанием субстрата и не указывает на отсутствие пропорциональности между начальной скоростью и концентрацией фермента. Пример такого рода был приведен [1918] для действия альдолазы (КФ 4.1.2.13).

При характеристике действия протеиназ на белки раньше часто пользовались «законом Шютца», согласно которому скорость протеолиза пропорциональна корню квадратному из концентрации фермента. Однако Боданский [474] показал, что это заключение является ошибочным в силу рассмотренного выше обстоятельства, т. е. из-за измерения не начальной скорости, а количества субстрата, гидролизованного за определенный период времени. Он рассчитал, что в действительности результаты самого Шютца указывают на прямую пропорциональность между начальной скоростью и концентрацией фермента, а не корнем квадратным из его концентрации.

г. Если препарат фермента содержит обратимо действующий ингибитор, который, соединяясь с ферментом, образует неактивный комплекс

E + I

EI,

(4.3)

Кинетика действия ферментов Рис. 4.9. Влияние добавления ингибитора к препарату фермента на скорость реакции [3473]. Фермент—трипсин (К.Ф. 3.4.21.4)./ — чистый трипсин; //— трипсин+ +ингибитор.

то доля фермента, находящегося в неактивной форме, будет увеличиваться по мере увеличения концентрации ингибитора в смеси. Так как ингибитор добавляется вместе с ферментом, то концентрации ингибитора и фермента увеличиваются одновременно; в результате активность, наблюдаемая при высоких концентрациях фермента, оказывается ниже той, которую следовало бы ожидать исходя из линейной зависимости. Иначе говоря, так как в реакцию (4.3) вступают две молекулы, а образуется только одна, то увеличение общей концентрации будет благоприятствовать реакции соединения, и, следовательно, при высоких концентрациях в неактивной форме будет находиться большая часть фермента. Этот случай является противоположным приведенному выше, в котором рассматривалось действие обратимо функционирующего активатора (случай 1.6).

Два примера такого рода приведены на рис. 4.8 и 4.9. Кривая / на рис. 4.8 показывает зависимость скорости гидролиза ri-нитрофенилсульфата недиализованным экстрактом печени крысы от концентрации фермента. Кривая // получена для того же препарата, подвергнутого тщательному диализу. Нелинейность в случае / есть результат подавления фермента следами фосфата, присутствовавшими в исходном экстракте; этот фосфат был удален при диализе, после чего была получена кривая // [5011].

Рис. 4.9 изображает данные для модельной системы, в которой ингибитор специально добавляли к препарату фермента [3473]. Кривая / была получена в опытах с раствором чистого трипсина (КФ 3.4.21.4), а кривая // — с раствором трипсина, к которому добавили ингибитор. Вообще если график зависимости между скоростью реакции и концентрацией фермента имеет вид, аналогичный кривой // на рнс. 4.9, то можно предполагать присутствие диссоциирующего ингибитора и следует попытаться удалить этот ингибитор диализом или каким-либо другим способом.

Выпуклость кривой зависимости скорости реакции от концентрации фермента может быть обусловлена полимеризацией

[Е], мл Глава 4

фермента, если активной является его диссоциированная форма, В эт

страница 22
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Ферменты. Том 1" (3.77Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(20.11.2018)