Биологический каталог




Ферменты. Том 1

Автор М.Диксон, Э.Уэбб

ермент достаточно хорошо очищен. Для тех же ферментов, которые еще не были получены в чистом виде (а таких ферментов много), изучение кинетики действия оказывается в настоящее время единственно возможным подходом при выяснении механизма ферментативного процесса.

Изучение кинетики действия ферментов важно не только с теоретической, но также и с чисто практической стороны. При выборе единицы активности фермента необходимо, например, знать наилучшие условия его действия, а также то, как влияют на его активность различные факторы. Подобное предварительное изучение кинетики действия обычно необходимо н для успешного осуществления очистки фермента, так как этот процесс должен количественно контролироваться путем систематических определений активности ферментного препарата на разных стадиях очистки (см. гл. 3).

Хорошо известно, что биологические системы, особенно живые клетки, более чувствительны к изменениям температуры, рН и ряда других факторов, чем большинство химических процессов в небиологических системах, и это является в основном отражением свойств ферментов, от действия которых зависит функционирование биологических систем. Поэтому знание кинетики действия ферментов помогает при анализе мнТГгйх 'биологических явлений. \

Кинетика, действия ферментов_83

Исследователю, имеющему дело с биохимическими системами, необходимо помнить о том, что обычные уравнения кннетн-кн, заимствованные нз физической хнмнн, в неизмененном виде не могут быть использованы для изучения действия ферментов. Исследование кинетики действия ферментов можно рассматривать как самостоятельный раздел. Гораздо важнее, однако, видеть в этих исследованиях неотъемлемую часть любого детального изучения фермента. Без данных о кинетике действия фермента невозможно решить вопрос о химическом механизме его функционирования или о том, как он действует в клетке. В обоих случаях изучение кинетики действия фермента на первых стадиях его исследования необходимо для планирования последующих экспериментов и интерпретации их результатов. Таким образом, кинетическое исследование следует рассматривать как необходимую основу при изучении фермента.

ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА СКОРОСТЬ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ

Факторы, определяющие характер течения ферментативных реакций, многочисленны и разнообразны (см. гл. 2), поэтому трудно получить кинетические уравнения, которые достаточно точно описывали бы наблюдаемые кривые хода ферментативных реакций. В ряде случаев, однако, условия протекания реакции относительно просты, и это позволяет получить уравнения, достаточно хорошо отражающие ход реакций (с такими примерами мы встретимся в следующем разделе). Обычно если определение скорости реакции можно осуществить прежде, чем какой-либо из указанных в гл. 2 факторов проявит свое действие, иными словами — в начальный момент времени, то возможными осложнениями вообще можно пренебречь.

Метод определения начальных скоростей ферментативных реакций описан в гл. 2. Как уже указывалось, наилучшим следует считать такой метод исследования, при котором изменяют только один из факторов (сохраняя все остальные условия неизмененными) и определяют влияние этого фактора на начальную скорость реакции. К числу главных факторов, определяющих начальную скорость ферментативной реакции, относятся: концентрация фермента, концентрация субстрата, "^Н, температура и присутствие активаторов или ингибиторов. В этой и последующих главах мы рассмотрим теперь каждый из этих факторов в отдельности.

А. ВЛИЯНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ФЕРМЕНТА

При данных условиях две молекулы фермента, действующие в растворе независимо друг от друга, за определенный проме-

6Глава 4

Рис. 4.1. Типичные примеры влияния концентрации фермевта на скорость реакции [3788J. /¦—ас-партат—аммиак-лиаза (К.Ф-4 3.1Л); // — фумаратгидратаза (К.Ф. 4.2.1.2); ///¦— акоиитат-гидратаза (К.Ф. 4.2.1.3).

жуток времени вызовут превращение в два раза большего количества субстрата, чем одна молекула; поэтому скорость реакции будет пропорциональна концентрации фермента

v=k[E]. (4.1)

В подавляющем большинстве случаев действительно имеет место подобное соотношение, и именно на нем основываются почти все методы определения концентрации ферментов. Типичные примеры приведены на рис. 4.1, однако от них могут наблюдаться отклонения, и прежде чем проводить дальнейшие кинетические исследования нлн пытаться рассчитать удельные активности, необходимо показать, что между скоростью н концентрацией фермента (в исследуемом диапазоне) имеется линейная зависимость. Отклонения от линейности нередко обусловлены несовершенством системы определения активности; встречаются, однако, случаи, когда такие отклонения являются следствием свойств самого фермента.

1. Вогнутые кривые я— [Е]

Возможные графики зависимости v—[Е] для этого случая приведены на рис. 4.2 и 4.3. Известны две причины подобного поведения.

Кинетика действия ферментов V

Рис. 4.2. Влияние токсичных примесей в реагентах иа скорость реакции.

а. Присутствие в одном из компонентов реакционной смеси (но не в растворе самого фермента) небольших количеств вы-сокотоксичиой примеси. Эта примесь отравляет первые порции добавленного фермента. Лишь после того как фермент (или другой белок, присутствующий в препарате фермента) будет добавлен в количестве, достаточном для того, чтобы связать всю токсичную примесь, последующие порции фермента полностью сохранят свою активность. При этом получают нормальный тип линейной зависимости, но прямая бывает смещена от начала координат на расстояние, пропорциональное количеству токсичной примеси. Если, например, фермент, как это часто бывает, чувствителен к следам ионов тяжелых металлов, то появление кривых такого рода может быть обусловлено присутствием небольших количеств меди в используемом буферном растворе или в дистиллированной воде.

б. Наличие диссоциирующего активатора или кофермента в препарате фермента. При обратимом взаимодействии образуется активный комплекс ЕА в соответствии с уравнением

Следовательно, доля фермента, находящегося в активной форме, увеличивается при увеличении в инкубационной смеси концентрации активатора. В данном случае активатор вводится в систему вместе с препаратом фермента, поэтому при увеличении концентрации фермента все большая доля его будет находиться в активированной форме и график зависимости v—[Е] будет вогнутым. В случае простой стехиометрии 1:1, отвечающей уравнению (4.2), следует ожидать квадратичной зависимости скорости от концентрации белка при сильном разведении. Однако при высоких концентрациях, когда фермент насыщен активатором, скорость окажется пропорциональной первой степени концентрации белка. Подобный эффект иллюстрирует рис. 4.3. На этом рисунке кривая / характеризует активность частично очищенной арилсульфатазы (КФ 3.1.6.1), которая была диализована против раствора хлористого натрия. В дейст-

Е + А = ЕА.

(4.2) Глава 4

Рис. 4.3. Влияние активатора, присутствующего в препарате фермента, на скорость реакции [5011]. Фермент—арилсульфатаза (К.Ф. З.1.6.1.). / — частично очищенная арилсульфатаза после "диализа против NaCl; // — то же в присутствии активатора (0,05 М

вительности фермент активируется ионами хлора, и, если активность определять при постоянной и оптимальной концентрации этих ионов, график будет представлять собой прямую (//) [5011, 5012]. Сходные кривые были получены [2145] для ряда протеиназ, нуждающихся в активаторе (рис. 4.4); в этих случаях, по-видимому, действует аналогичный механизм. В отсутствие активатора или при активации добавленным цианидом активность зависит от малых количеств тиоловых соединений, присутствующих в препарате фермента, и потому на графике видны отчетливые вогнутые кривые. При активации тиоглико-латом концентрация тиоловых групп не изменяется с изменением концентрации фермента и зависимость бывает близка к линейной.

Особенно интересен случай, когда активный фермент является комплексом субъединиц, каждая из которых в отдельности не активна; таким образом, можно считать, что данная субъеди-

Рнс. 4.4. Влияние активатора [2145]. Гидролиз бензоиларгннин-амида фицнном (К.Ф. 3.4.4 3). I — активатор не добавлен; // — активирование цианндрм; /// — активирование тиоглнколатом.

0 0,05 0,1

[Е] (мг белкового N в 1 мл)

Кинетика действия ферментов Рнс. 4 5 Влияние ассоциации субъ-единнц [2084]. Активность фос-фофруктокиназы определяли прн концентрации F-6-P 200 мкМ; / — [АТР] =200 мкМ, [АМР] =

=200 мкМ; // — [АТР] =500 мкМ; /// — [АТР] = 500 мкМ, [Цитрат] =500 мкМ.

ница активируется при взаимодействии с другой. Поскольку увеличение концентрации способствует агрегации субъединиц, график зависимости скорости от концентрации фермента будет иметь вид вогнутой кривой. Было показано, что подобная ситуация наблюдается для фермента 6-фосфофруктокиназы (КФ 2.7.1.11) [2084], см. рис. 4.5. В растворе этот фермент обратимо диссоциирует на субъединицы, при этом активна только агрегированная форма. AMP связывается с агрегированно

страница 21
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Ферменты. Том 1" (3.77Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(24.09.2018)