Биологический каталог




Ферменты. Том 1

Автор М.Диксон, Э.Уэбб

трудности. Удобным и быстрым методом обессоливания является гель-фильтрация, которую обычно пррводят на колонках с сефадексом. Этот метод с успехом применяется для обессоливания разных объемов растворов вплоть до 1 л, хотя стоимость больших колонок весьма велика. Диализ —очень медленная операция, часто самая медленная из применяемых при очистке ферментов, но она не требует сложных аппаратов и поэтому очень дешевая. Тем не менее для обработки нескольких литров ферментного раствора, с которыми приходится работать на ранних стадиях фракционирования, требуется много метров целлофановых трубок. Если учесть к тому же, что диализ идет очень долго, его следует применять только в случае относительно небольших объемов жидкости. Однако если проводить диализ не до полного удаления солей и при частой смене жидкости, то процесс можно ускорить. Мак-Фай [3092] предложил много практических рекомендаций, которые следует учитывать при диализе.

Ер время диализа возможна потеря активности фермента — либо из-за нестабильности самого фермента, либо из-за удале-)Ния, какого-то кофактора. Однако наиболее частая причина инактивации — попадание в раствор фермента из воды следов метаддо$-ин{гибиторов (например, Си), если для диализа не применяется очень чистая вода. Ферменты обычно имеют очень большое сродство к этим ингибиторам, и даже если концентрация ионов металла в воде чрезвычайно мала, фермент может связать все количество металла, имеющееся в весьма большом .объеме воды. Это не имеет особого значения при работе с неочищенными препаратами, но зато очень важно на последних стадиях очистки фермента,

Мнргие хроматографические и все электрофоретические процедуры более удобно проводить с малыми объемами материала, и поэтому лучше ими пользоваться на более поздних стадиях очистки ферментов. Фракционирование сульфатом аммония, а также некоторые хроматографические методы, в частности использующие элюцию субстратом, позволяют получить очень концентрированные растворы фермента, подходящие для кристаллизации; поэтому они часто используются как заключительные стадии очистки.

К. ДРУГИЕ МЕТОДЫ

Значительная часть работ по очистке ферментов, проводившихся вплоть до настоящего времени, выполнялась с помощью четырех главных методов, упомянутых выше, а именно с помощью осаждения органическими растворителями, адсорбции на гелях, фракционирования сульфатом аммония и хроматографии на колонках. Представляется вполне вероятным, что боль-

Выделение ферментов шинство ферментов можно очистить, пользуясь комбинацией только этих методов. В действительности с увеличением степени специфичности, которой можно достигнуть в некоторых хрома-тографических процедурах, становится возможным получить практически чистый фермент за одну стадию очистки [3497]. Однако нет сомнений, что во многих случаях целесообразно использовать широкий ассортимент приемов. Не исключено, что в особых случаях, когда перечисленные выше методы не дают желаемого результата, станет необходимо применение других методов, которые мы здесь не рассматривали.

Иногда на ранних стадиях очистки можно удалить большое количество белковых примесей без потери фермента путем осторожного добавления солей тяжелых металлов, например евин* ца [295], правда, слишком большое количество свинца может привести к потере фермента. В ряде случаев ферменты осажда^ ли добавлением нуклеиновой кислоты [4988], которую затем удаляли, осаждая ее протамином.

На ранних стадиях очистки большое количество неактивного белка можно удалить по методу [4806], в основе которого лежит денатурация белков при встряхивании их растворов со смесью спирта и хлороформа. Этот метод особенно полезен дЛя удаления гемоглобина из экстрактов тканей животных или из эритроцитов [486, 1919].

Л. КОНЦЕНТРИРОВАНИЕ

Обычно при очистке фермента по одному из описанных выше методов объем раствора уменьшается, однако бывают особые случаи, когда требуется концентрировать раствор фермента до еще меньшего объема. Описан ряд методов, с помощью которых это можно осуществить. Растворитель удаляют выпариванием, частичным замораживанием раствора и отбрасыванием образовавшегося льда, а также высушиванием растворов из замороженного состояния (лиофилизация). Ни один из этих методов не является полностью удовлетворительным, так как ни в одном из них не исключена денатурация фермента, и, кроме того, при использовании всех этих методов концентрируется не только фермент, но и соли. Упаривание путем обдувания током воздуха целлофановых диализных трубок, в которые помещен раствор фермента, считается удачным приемом, если объемы жидкости, подлежащие упариванию, относительно малы; однако в этом случае также происходит концентрирование солей. Более приемлемым можно считать две другие процедуры с использованием мембран [458]. Одна из них — диализ против непроходящих через мембрану набухающих макромолекул, таких, как полиэтиленгликоль или декстраны,—приводит к очень быстрому Глава 3

уменьшению объема достаточно большого количества раствора. (Декстраны, в частности в форме сефадекса, и некоторые препараты полиакриламидов можно добавлять непосредственно в растворы фермента; после того как декстран оседает или его отделяют на центрифуге, фермент в надосадочной жидкости оказывается сконцентрированным; однако часть вещества при этом неизбежно теряется из-за адсорбции.) Вторая процедура— концентрирование раствора с помощью ультрафильтрации — по-видимому, наиболее ценный метод из имеющихся в настоящее время, тем более, что мембраны с различным размером пор имеются в продаже. При ультрафильтрации раствор фермента помещают в камеру, снабженную мембраной, через которую не проходит выделяемый белок, но проходят растворитель и малые молекулы. Приложенное к раствору давление или создание в камере вакуума, где собирается жидкость, способствуют движению жидкости через мембрану. Довольно большие объемы растворов можно довести до нескольких миллилитров за один-два часа. Для концентрирования белков с низкой молекулярной массой надо, Очевидно, использовать ультрафильтры с малым размером пор, но для более высокомолекулярных белков удобнее использовать фильтры с большими порами, так как растворитель будет через них протекать быстрее. Хорошие результаты получают, используя вначале ультрафильтр с большими порами, через которые проходит фермент, а затем ультрафильтр с малыми порами, которые задерживают данный фермент; этот прием является одновременно и методом очистки и методом концентрирования фермента.

КРИТЕРИЙ ЧИСТОТЫ ФЕРМЕНТОВ

Вероятно, единственного теста, с помощью которого можно было бы доказать, что выделенный продукт состоит только из одного белка — собственно фермента, не существует. На основании данных какого-либо одного теста о чистоте продукта можно говорить лишь с известной степенью вероятности. Если же продукт оказывается гомогенным при проверке несколькими различными тестами, то эта вероятность значительно увеличивается и фермент может быть признан чистым.

Большинство тестов на гомогенность основаны на определении физических свойств белка, которые используются для проверки гомогенности любых белков. С помощью ультрацентрифугирования и гель-фильтрации проводят дифференцировку по размеру молекул, а электрофорез и изоэлектрическое фокусирование позволяют дифференцировать белки по заряду. Если фермент имеется в большом количестве, то проверить чистоту препарата можно также по тесту растворимости. Для ферментов

\

_ Выделение ферментов 77

-v-

существуют и дополнительные тесты, основанные на присущей им каталитической активности, и эти тесты могут убедительно подтвердить данные, полученные с помощью физических методов.

Чтобы определить, седиментирует ли анализируемый белок в виде одного компонента, используют аналитическую ультрацентрифугу. Поведение белка при седиментации зависит от размера его молекул и их формы. Следует отметить, что если при использовании шлирен-оптики (метод скрещенных диафрагм) наблюдают один пик, то это еще не достаточно надежное доказательство гомогенности препарата. Не исключено, что константы седиментации многих белков мало различаются, и поэтому в смеси, состоящей из двух белков, оба белка могут иметь приблизительно одинаковую скорость седиментации. Асимметрия пика может указывать на присутствие примесей; нужно помнить, однако, что этот метод не отличается достаточной чувствительностью и примеси могут остаться совершенно незамеченными. В ходе седиментации нельзя определять фер| ментативную активность, однако при центрифугировании в гра»-диенте плотности с последующим отбором проб в разных зонах градиента возможно определение и концентрации белка, и ферментативной активности. Один симметричный пик белка с постоянной удельной активностью фермента по всему пику является указанием на вероятную чистоту препарата. Выход белка при гель-фильтрации в виде одного пика с постоянной удельной активностью также является показателем его чистоты, однако следует иметь в виду, что белки, имеющие сходный размер молекул, и при этой процед

страница 19
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Ферменты. Том 1" (3.77Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(10.12.2018)