Биологический каталог




Ферменты. Том 1

Автор М.Диксон, Э.Уэбб

пользуют градиент плотности, поскольку в каждой зоне может накапливаться большее количество белка и обычно требуется меньше времени для разделения [1344]. Однако элю-ирование фермента после изоэлектрического фокусирования в геле более трудоемко. Метод зонального электрофокусирования (zone convection) сочетает ряд преимуществ обоих упомянутых выше вариантов. В этом методе электрофокусирование протекает в серии U-образных трубок (оптимально от 50 до 100), соединенных друг с другом, и не используются ни гель, ни градиент плотности. Внесение образца и элюирование проб осуществляются легко, причем можно наносить большое количество белка; однако время, требующееся для разделения, такое же, как и в варианте с градиентом плотности [4898].

Принцип изоэлектрического концентрирования белков был также использован при очистке белков методами электрофореза в геле и электродекантацией. В первом случае электрофорез в крахмальном геле проводят при рН, соответствующем изоэлектрической точке фермента, и последний остается на старте, в то время как другие белки уходят со старта. Исследуемый фермент извлекают из зоны нанесения образца [4135]. При электродекантации между двумя электродами помещают ряд камер,

Выделение ферментов

сообщающихся через полупроницаемые мембраны. В' электрическом поле белки, несущие заряд, накапливаются около полупроницаемых мембран, и при возрастании плотности раствора последний перемещается книзу, где может быть собран через отверстие для слива. Белок, находящийся в условиях опыта в изоэлектрической точке, остается в центре камеры и может быть собран отсасыванием и перенесен в соседнюю камеру для-дальнейшей очистки [5116].

3. КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ

Когда фермент достаточно очищен, в отдельных случаях удается его закристаллизовать. Однако получение фермента в кристаллическом виде не должно рассматриваться как доказательство его чистоты. Первые кристаллы белка или фермента могут содержать посторонние белки. При перекристаллизации удельная активность кристаллов возрастает; иногда требуется перекристаллизовывать их несколько раз до тех пор, пока удельная активность фермента не достигнет постоянного максимального значения. Поэтому кристаллизацию лучше всего рассматривать как специфический метод фракционирования, который следует использовать_яа^крнечных стадиях очистки, когда ферментный раствор сконцентрирован и имеет небольшой объем. Кристаллы чистого фермента могут быть использованы для исследования его структуры (гл. 10).

Кристаллизацию ферментов часто проводят из растворов сульфата аммония. Обычный метод состоит в добавлении соли к достаточно концентрированному раствору фермента до Появления слабого помутнения. Затем раствор оставляют стдятъ—и постепенно (очень медленно) повышают концентрацию соли. Это можно сделать различными способами: добавляя концентрированный раствор соли по каплям с большими интервалами с помощью очень тоненького капилляра или добавляя соль через мембрану для диализа, или, наконец, просто подвергая раствор медленному испарению. Прежде чем будет получен удовлетворительный результат, могут оказаться необходимыми эксперименты при нескольких значениях рН и температуры.

Кристаллизацию проводят также при постоянной концентрации солей, постепенно изменяя рН или температуру.

Джекоби [2197] описал общий метод кристаллизации, который включает экстракцию небольшой порции осажденного фермента последовательно все более разбавленными растворами сульфата аммония на холоду. После каждого добавления раствора суспензию центрифугируют, прозрачный надосадочный раствор сливают и оставляют при комнатной температуре. В этих условиях через больший или меньший период времени обычно появляются кристаллы. Глава 3

Нельзя дать общие правила кристаллизации ферментов — наиболее подходящие условия должны быть найдены экспериментально в каждом отдельном случае; обзор Цока и Бюхера ?941], посвященный этому вопросу, содержит ряд полезных сведений. Кристаллизация обычно облегчается, если одной из предшествующих стадий было фракционирование органическим растворителем. Это явление, вероятно, связано с удалением какого-то мешающего кристаллизации материала липидной природы.

В отдельных случаях удается кристаллизовать ферменты и другими путями, например из их растворов в органических растворителях. Там, где другие методы непригодны, может оказаться эффективной кристаллизация фермента в виде соли тяжелого металла, но в таких случаях перед определением активности фермента необходимо удалить металл.

Появление кристаллов, обладающих ферментативной актив-костью, отнюдь не является доказательством того, что закристаллизовался сам фермент. Много разочарований было связано с тем, что иногда кристаллы либо имели неорганическую природу, либо состояли из побочного белка, содержащего небольшую примесь фермента. Лучшей проверкой чистоты кристаллов служит перекристаллизация. Падение активности указывает на то, что фермент присутствует в кристаллах в виде примеси, тогда как ее увеличение до некоего постоянного значения свидетельствует о том, что кристаллы состоят из самого фермента.

И. ЧЕРЕДОВАНИЕ МЕТОДОВ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ

Следует рассмотреть последовательность применения различных методов фракционирования при выделении чистого фермента. Очевидно, что кристаллизацию следует проводить в конце очистки фермента, тогда как прогревание логично проводить вначале, поскольку оно имеет целью удалить большое количество балластного белка и поскольку при нем не требуется добавлять большие объемы жидкости, сильно затрудняющие работу. Во многих случаях, однако, тепловая обработка нежелательна либо до причине нестабильности фермента, либо из-за присутствия таких ферментов (например, протеиназ), которые при повышенной температуре могут вызвать слишком большое разрушение белков, либо, наконец, просто потому, что степень достигаемой при этом очистки невелика и, следовательно, затраты труда не оправдываются. Однако для удаления некоторого количества балластного материала часто бывает очень удобно в качестве первой стадии фракционирования неочищенного экстракта использовать такие методы, как нагревание, слабое подкисление, обработка хлороформом или адсорбция на образующемся in situ фосфате кальция. Обработка экстракта

Выделение ферментов таким путем может оказаться очень полезной для успешного проведения последующих стадий очистки, в частности для более полного отделения надосадочной жидкости от осадка при фракционировании солью, а также для предотвращения засорения хроматографических колонок.

Остается выбор между солями, органическими растворителями, адсорбентами, хроматографией и электрофорезом. Наилучший порядок чередования приемов очистки определяют экспериментально, но при этом следует учесть несколько моментов. На ранних стадиях очистки чаще всего имеют дело с большими объемами ферментного раствора, и использование органических растворителей на этих стадиях, естественно, ограничивается размерами имеющейся центрифуги с охлаждением. Такой центрифуги не требуется, если исходный материал представляет собой стабильный сухой препарат, который можно использовать для работы в небольших удобных порциях. В качестве первой стадии очистки фермента можно использовать осаждение белков сульфатом аммония, но и в этом случае придется центрифугировать большие объемы растворов. Удобно также использовать сепараторную центрифугу или, если время не является лимитирующим фактором, можно отделить осадок из большого объема фильтрованием. Преимущество солевого фракционирования в качестве ранней стадии очистки состоит в том, что не нужно предварительно проводить диализ или обессоливание,, поскольку для его проведения состав среды не имеет существенного значения. Адсорбция и хроматография на больших колонках также очень удобны в качестве первой ступени при фракционировании фермента; в первом случае обычно требуется предварительный диализ раствора, а для второго метода может оказаться достаточным разбавление пробы до такой степени, чтобы содержание электролитов не препятствовало сорбции на колонке. Если можно предварительно провести диализ", то адсорбцию следует считать наилучшей первой стадией очистки. Адсорбенты обычно оседают достаточно быстро, так что через короткий промежуток времени большую часть жидкости можно слить с осадка и таким образом избежать центрифугирования большого объема. При использовании хроматографии можно значительно сконцентрировать фермент в малом объеме.

Элюаты, полученные при адсорбционном фракционировании' или хроматографии, содержат соли, поэтому логично вслед за' адсорбцией провести фракционирование сульфатом аммония,, чтобы таким образом избежать дополнительной стадии диализа. Диализ или фильтрование требуются после фракционирования-сульфатом аммония (если за первым фракционированием сразу не следует второе), но при этом уже имеют дело с меньшим объемом жидкости, и поэтому обессоливание провести значительно легче. Обессоливание очень больших объемов жидкости Глава 3

представляет значительные

страница 18
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Ферменты. Том 1" (3.77Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(19.10.2018)